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黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因(lipC)转录调控因子的研究

胡国库  
【摘要】: 黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)属于白腐担子真菌,是研究木质素生物降解的模式生物,因其具有出色的降解木质素的能力,而且对环境中的有毒物质、爆炸污染物等也有降解作用,因此P. chrysosporium在造纸工业、环境保护等方面具有重要的应用前景。研究表明,P.chrysosporium降解木质素是由众多的胞外过氧化物酶参与的复杂的生物过程,LiP和MnP是主要的2类过氧化物酶。Northern blot和RT-PCR分析表明。这2类酶均受到C、N、O等因素的调节,暗示在其基因的5’-端可能存在顺式调控元件与反式作用因子相互作用调控基因的转录。已有的研究表明,在lipC 5’-端存在2个蛋白质结合元件——PBE1和PBE2。本研究在这一工作的基础上做了如下两方面的研究工作。 首先,分别以PBE1、PBE2和PBE1+PBE2为钓饵,利用酵母单杂交技术对低氮培养基中培养3d P. chrysosporium的eDNA文库进行筛选,研究结果表明:以PBE1为钓饵筛选到9个cDNA序列;以PBE2为钓饵筛选到的6个序列;以PBE1+PBE2为钓饵所筛选到10个序列。对这25个eDNA序列进行了较系统的生物信息学分析。结果表明,只有4个序列编码的蛋白质能定位在细胞核中,编号是PBE1-A20.3、PBE1-A12.4、PBE2-A5.1和PBE1-2-A27.1,因此对这4个克隆进行了较深入的分析。序列分析表明,PBE1-A20.3编码一种未知蛋白;PBE2-A12.4编码的蛋白质与多功能蛋白14-3-3有较高的同源性,而14-3-3蛋白参与细胞凋亡、细胞分裂、信号转导、蛋白跨膜转运、基因转录等众多重要生命活动过程,14-3-3蛋白主要以蛋白质一蛋白质相互作用的方式发挥功能。在动物、植物以及酵母中,14-3-3还可以与十字型DNA结合调节DNA复制。功能位点分析表明,PBE2-A5.1编码蛋白质含有1个ATP结合结构域和1个亮氨酸拉链结构,很多调控蛋白质中含有亮氨酸拉链结构,包括CCATT盒及增强子结合蛋白、cAMP应答元件(CRE)结合蛋白、酵母一般调控蛋白GCN4、octamer-结合转录因子2(Oct-2/OTF-2)等。PBE1.2-A27.1编码的蛋白质含HIT(histidine triad)结构域,含该结构的蛋白可以与核酸结合。 为进一步鉴定酵母单杂交筛选到的阳性克隆与顺式元件的结合作用,利用pET-28a载体对筛选到的14-3-3蛋白编码序列进行原核生物表达,SDS-PAGE分析表明,14-3-3蛋白在Escherichia.coli BL21中以部分包涵体和部分可溶性形式存在,分子量为33 kD。通过Ni柱纯化得到E.coli中可溶表达的14-3-3蛋白,并用透析和PEG20000浓缩该蛋白用于体外结合实验(GMSA)。表达的14-3-3蛋白与~(32)p标记的PBE1+PBE2探针混合后,经低离子强度聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射自显影表明,14-3-3蛋白电泳有明显的延迟现象,当加入40倍的冷探针后,延迟现象减弱,加大14-3-3蛋白量后,延迟现象增强,表明14-3-3蛋白可以与该探针特异结合。 在上述研究工作基础上,以14-3-3蛋白为钓饵,利用酵母双杂交技术筛选P.chrysosporium 3d eDNA文库,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp缺陷培养基平板上共获得了约601个单克隆。进一步分析发现,只有少部分克隆可激活3个报告基因。分离自这些克隆中的质粒DNA转化大肠杆菌,利用HaellI和Sau3AI限制酶切分析可将其分为9类。序列测定和同源分析结果表明,测定的6个序列均具有多个潜在的磷酸化位点,也是14-3-3蛋白潜在的结合位点。其中有2个序列具有WD结构域,表明14-3-3蛋白在P.chrysosporium中也是一个多功能蛋白质。Y2H147与转录因子有一定相似性。高级结构分析显示,P.chrysosporium中的14-3-3蛋白与其它物种中的一样,含有9个Helix结构,且可以形成杯状的同源二聚体结构。蛋白质.蛋白质预测结果显示,14-3-3蛋白可以与Y2H147、389、412号克隆结合,推测14-3-3蛋白在P.chrysosporium中参与多个细胞过程,尤其在基因转录调控过程中发挥某种作用。另外,RT-PCR分析表明14-3-3基因在P.chrysosporium不同代谢阶段没有明显的转录差异。


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