拟南芥中与谷氨酰tRNA合成酶相互作用蛋白的筛选及相关转基因植物抗逆性研究
【摘要】：
植物激素脱落酸(ABA)广泛的分布于某些真菌和植物的各器官内。在植物的生长发育过程中起着重要作用，可参与调控特定基因的转录、翻译水平从而调节种子的休眠和萌发。随着深入研究发现在逆境下植物的根部和叶片部位有ABA的积累，并且ABA可以通过对离子通道开／关及对渗透压的调节从而引起气孔的开／关，从而与植物抗逆性密切相关。以野生型ABI2作诱饵蛋白使用酵母双杂交系统筛选拟南芥的cDNA文库时发现谷氨酰tRNA合成酶与其有相互作用，因而推测谷氨酰tRNA合成酶可能参与植物的抗逆行为。
在生物体内，氨酰tRNA的主要作用是在蛋白质合成过程中保证氨基酸和氨酰tRNA准确配对，从而保证蛋白质合成的正确性，其催化特异性对遗传信息的准确传递十分重要，然而不同氨酰tRNA合成酶在植物体内还承载了其它的重要职能，维持机体的正常生命活动。本论文的部分实验即通过研究对谷氨酰tRNA合成酶过量表达和抑制表达的六个转基因株系在不同的生长胁迫条件下种子萌发率和根生长情况，验证和进一步探究谷氨酰tRNA合成酶参与植物抗逆途径，及其对植物生理性状的影响。
本论文中部分实验还利用酵母双杂交系统，以氨酰tRNA合成酶为诱饵，筛选相互作用蛋白，从而完善ABA的信号传导系统。实验根据Clontech提供的方法，利用PEG／LiAc法转化酵母细胞。以22℃，光照16h／d生长2—3周的拟南芥RLD型幼苗为材料抽提总RNA，反转录第一链cDNA，构建筛选目的基因的cDNA文库。将编码诱饵蛋白的基因片段连接到可以编码融合蛋白的BD载体(即pGBKT7)构建诱饵质粒。将BD重组子，cDNA文库和AD载体质粒共转化进入酵母感受态细胞内，涂布于不含色氨酸、亮氨酸和组氨酸的三缺SD选择性平板培养基(SD／-Leu／-Trp／-His)上培养4—10d直至生长出候选的阳性克隆。将这些候选阳性克隆分别在SD两缺培养基(SD／-Leu／-Trp)和SD三缺培养基(SD／-Leu／-Trp／-His)上画线培养以确定其His报告基因的表达。将生长在SD两缺培养基上的菌落画线于干燥滤纸上，利用β-半乳糖苷酶(β-LacZ)显色反应检测菌落中LacZ报告基因的表达，以剔除部分假阳性克隆。提取经检测后仍显示阳性的酵母克隆菌落的总DNA，得到相互作用的BD和AD质粒，并将其转化大肠杆菌，以便分离得到AD重组子，使用特异的AD载体质粒的引物进行PCR检测进一步验证阳性克隆。从大肠杆菌AD转化子的阳性克隆中，提取AD重组质粒，使用两种非限制性内切酶对其进行处理，根据酶切图谱分组，去除重复的相互作用蛋白。再将从分组筛选后的这些候选阳性克隆中得到的重组质粒再与pGBKT7一起转化到AH109酵母菌中，检测转化子的His和LacZ报告基因的表达情况进行试验结果的最终验证。
【关键词】：谷氨酰tRNA合成酶 酵母双杂交 脱落酸 植物抗逆性 转基因植物 【学位授予单位】：四川大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：Q943
【目录】：
- 中文摘要7-9
- 英文摘要9-12
- 前言12-16
- 第一部分 在拟南芥中利用酵母双杂交技术筛选与谷氨酰tRNA合成酶有相互作用的蛋白质16-56
- 1.材料16-26
- 1.1 植物材料16
- 1.2 菌种16
- 1.3 质粒载体16-19
- 1.4 生化试剂,酶制剂,试剂盒及仪器19
- 1.5 培养基及溶液配制19-26
- 2 实验方法26-48
- 2.1 DNA-BD/GTS(fc)和DNA-BD/GTS(ΔC)载体的制备26-34
- 2.1.1 GTS(fc)片段的获得26-31
- 2.1.2 GTS(ΔC)片段的获得31-33
- 2.1.3 质粒载体的制备33
- 2.1.4 连接DNA-BD/GTS(fc)和DNA-BD/GTS(ΔC)载体33-34
- 2.1.5 连接片段向大肠杆菌的转化34
- 2.1.6 重组质粒的鉴定34
- 2.2 拟南芥cDNA文库的构建34-42
- 2.2.1 拟南芥的培养34-35
- 2.2.2 拟南芥总RNA的提取35-36
- 2.2.3 RNA鉴定36-37
- 2.2.4 合成第一链cDNA37
- 2.2.5 长程PCR(LD-PCR)扩增双链cDNA37-38
- 2.2.6 纯化双链cDNA38-39
- 2.2.7 Carrier DNA 的制备39-40
- 2.2.8 酵母感受态细胞的制备40-41
- 2.2.9 采用共转化法将pGBKT7-GTS(fc),dscDNA及pGADT7-Rec转化于AH109菌中41-42
- 2.3 阳性克隆的筛选42-45
- 2.3.1 β-半乳糖苷酶(β-LacZ)活性检测42
- 2.3.2 阳性克隆的获得42
- 2.3.3 PCR和酶切检测阳性克隆42-44
- 2.3.4 TaqI,BsuRI酶切,分组44-45
- 2.4 pGADT7-Rec-cDNA的获得45-47
- 2.4.1 E.coli JM109感受态细胞的制备45
- 2.4.2 BD和AD转化至E.coli JM109感受态细胞45-46
- 2.4.3 转化子阳性克隆的检测46
- 2.4.4 小量提取pGADT7-Rec-cDNA质粒46-47
- 2.5 阳性克隆的再次检测47-48
- 2.5.1 顺次转化47
- 2.5.2 β-半乳糖苷酶(β-LacZ)活性检测47
- 2.5.3 测序分析47-48
- 3 结果与分析48-56
- 3.1 诱饵表达载体pGBKT7-GTS(fc)和pGBKT7-GTS(ΔC)的构建48-49
- 3.2 酵母双杂交49-50
- 3.3 相互作用蛋白的β-半乳糖苷酶(β-LacZ)活性检测50-52
- 3.4 阳性克隆的检测52-53
- 4.讨论53-56
- 第二部分 拟南芥转基因株系的抗逆表型研究56-68
- 1.材料56-57
- 1.1 植物材料56
- 1.2 实验试剂56
- 1.3 培养基56-57
- 2 实验方法57-59
- 2.1 胁迫压的选择57-58
- 2.2 种子萌发率实验58
- 2.3 根生长状况实验58-59
- 3 结果与分析59-65
- 3.1 种子萌发率59-63
- 3.2 根生长状况63-65
- 4.讨论65-68
- 文献综述68-87
- 参考文献87-95
- 在读硕士期间发表论文和获奖情况95-96
- 致谢96-97
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