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《四川大学》 2007年
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斑马鱼VEGFD基因完整ORF克隆及其在血管系统发育过程中功能的研究

宋敏  
【摘要】: 血管内皮生长因子VEGF家族被认为是最为重要的分泌型促血管生成因子,在胚胎血管系统发育和肿瘤血管生成过程中均发挥重要作用,包括VEGFA,VEGFB,VEGFC,VEGFD,VEGFE和VEGFF。大量研究表明人VEGFD能够诱导肿瘤内淋巴管的生长,促进淋巴结转移,并可作为一个肿瘤预后因子应用于临床。有实验表明在人VEGF家族中VEGFD能与VEGFR2和VEGFR3结合,是最强的促血管生成和淋巴生成因子。但小鼠的VEGFD只能与VEGFR3结合,不能与VEGFR2结合。因此需要建立一个新的实验模型,以详细研究VEGFD在促血管生成过程中的分子作用。斑马鱼以其生殖能力强,发育周期短,通体透明,在形态和生理结构上与哺乳动物相似等特点被广泛地应用于遗传,发育研究及药物筛选方面。具有功能的包含主血管和分支血管的血管系统在斑马鱼发育到第3天便可清晰呈现。此外,斑马鱼胚胎在缺乏循环系统的情况下还能够至少存活发育一周时间。所以斑马鱼是一个良好的体内分析血管系统的模型。 在本研究中,首先以人的VEGFD氨基酸序列通过blast搜索,结合基于基因组预测的策略获得了斑马鱼VEGFD的编码区(ORF)序列,长816bp,编码272个氨基酸。生物信息学分析显示,斑马鱼VEGFD位于11号染色体,包含6个外显子和5个内含子。RPSBLAST软件结构域分析显示斑马鱼VEGFD氨基酸序列中,第105到第188氨基酸为其保守结构域,并且含有与结构功能紧密相关的保守的8个半胱氨酸。系统树分析表明哺乳动物中负鼠的VEGFD与斑马鱼的VEGFD在进化上最为相似。CLUSTAL W多序列比对分析表明斑马鱼VEGFD与斑马鱼的VEGFC有39%的同源性,而与人和小鼠的VEGFD则分别有40%和39%的同源性。为验证和克隆斑马鱼VEGFD编码区序列,在其起始密码子ATG和终止密码子TGA处设计上,下游引物,以成鱼总RNA为模板经一步法RT-PCR扩增出了目的条带,重组入T-easy载后测序,与预测结果完全一致。为研究VEGFD在斑马鱼各发育时期的表达情况,提取斑马鱼各发育时期总RNA,以EF1为内参,进行一步法半定量RT-PCR。结果显示,斑马鱼VEGFD的表达起始于13体节期,在受精后24小时表达量明显升高。再通过BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,构建VEGFD—pCDNA3.1重组质粒重组质粒。然后用XhoⅠ进行单酶切将其线性化,纯化后,作为体外转录模板,进行体外转录,加尾并纯化所得的斑马鱼VEGFD mRNA,用于显微注射用的。将VEGFD mRNA显微注射至单细胞期的斑马鱼受精卵内,并观察记录表型变化。注射后36小时,循环完全阻断和循环回路缩短两种血液循环异常,以及心跳减缓,血细胞堆积在尾部的现象。在荧光倒置显微镜下观察斑马鱼发现体节间血管排列异常,或缩短。尾部的血管丛膨大为腔等血管发育的异常。但表型异常的斑马鱼中没有观察到血管过度生长的现象。为了观察排列异常的体节间血管的血液流动情况,通过往斑马鱼胚胎主静脉静脉窦或围心腔中注射红色荧光染料罗丹明—葡聚糖溶液以显示血液流动情况。微血管成像后发现过表达VEGFD的斑马鱼血液只流经背主动脉和后尾静脉,体节间血液循环缺失。综上所述,本研究克隆并鉴定了斑马鱼VEGFD基因,发现它在斑马鱼血管系统发育过程中发挥重要作用,从而提供了一个较小鼠更为合适的用以研究VEGFD在血管系统中功能的实验模型。
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