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《四川大学》 2007年
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林麝γ-干扰素基因的克隆及表达

陈桂兰  
【摘要】: 林麝(Moschus berezovskii)是我国一级珍稀濒危保护动物。林麝分泌的麝香是高级香料,也是我国和东亚地区传统的珍贵药材,因此林麝具有很高的药用价值和经济价值。因为过度捕杀以及生境的丧失,林麝种群数量锐减。我国具有多年的麝驯化和人工养殖历史,在1958年就开始了人工圈养以及保护野生的林麝,并且也取得了一定的成效,但是目前人工养麝的技术不完善,圈养的林麝很容易受细菌、病毒感染,化脓性疾病一年四季都有发生,呈散发形式,表现慢性病程,发病多,病程长,治愈率低,虽不及其他传染病那样来势凶猛,但死亡率高,约为麝群总死亡数的50%~70%,在疾病防治上一直没有取得很大突破。 IFN-γ(interferon gamma)是免疫系统的重要调节因子,主要由T细胞和NK细胞产生,能够全面促进体液免疫和细胞免疫。IFN-γ可增加T、B淋巴细胞的激活和IgG的Fc受体表达;显著增强抗原呈递细胞表达MHC类抗原,增强抗原呈递细胞与T细胞的相互作用,进而增强T细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒T细胞产生的能力;诱导巨噬细胞产生体液免疫应答,使机体免疫力显著增强。在人和其他物种中,IFN-γ已用于病毒性感染和肿瘤等多种疾病的临床治疗。因此,为了应用IF-γ对林麝进行免疫治疗,提高林麝对外界环境的免疫水平,我们对此基因做了克隆、分析及原核、真核表达。 根据水牛(Bos taurus,M29867)IFN-γ基因的cDNA全序列为参考,设计两条克隆引物,从经ConA诱导的林麝外周血淋巴细胞(peripheral bloodmononuclear cells,PBMC)总RNA为模板,运用RT-PCR技术扩增出编码林麝IFN-γ的基因并将其克隆到pMD18-T载体上。经筛选、菌落PCR鉴定、测序、序列分析,证实为林麝IFN-γ基因编码序列,全长498bp,编码166个氨基酸,与偶蹄目动物赤鹿、牛、羊的IFN-γcDNA序列高度相似。 将林麝IFN-γ重组到原核表达载体pGEX4T-1中,转化E.coli BL21,在IPTG诱导下实现了高效表达,SDS-PAGE分析得到约43KDa的蛋白质条带,与GST(Glutathione S-transferase)融合蛋白的预期分子量一致,表达量约占细菌总蛋白的26.9%。经NaOH法变性复性后,用GSTrap亲和柱对蛋白进行了纯化。 将林麝IFN-γ基因与真核表达质粒pPIC9K连接,转化E.coli JM109,通过菌落PCR、测序筛选构建正确的重组质粒,经线性化后电转化毕赤酵母GS115,再经G418抗性筛选、酵母菌落PCR鉴定,得到多个重组酵母,对这些酵母进行诱导表达、SDS-PAGE、反转录分析,在两株重组酵母经甲醇诱导4d的上清中检测到了约17.3KDa的诱导表达带,但表达量极低,这表明林麝IFN-γ在毕赤酵母中的表达是低水平的,而在大肠杆菌中的表达量相对较高。 本研究成果为进一步研究林麝IFN-γ的生物学活性及其临床应用奠定了基础,对林麝异地保护具有重要意义。
【学位授予单位】:四川大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q78

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