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《四川大学》 2007年
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斑马鱼新基因KLP的克隆、分析及功能研究

李培  
【摘要】: 本试验采用交叉免疫学筛选新基因,经过生物信息学分析希望克隆到与胚胎发育或疾病相关并具有重要功能的新基因。基于SEREX策略,利用人脐静脉内皮细胞免疫兔血清筛选斑马鱼心脏cDNA表达文库,阳性克隆经核酸测序,生物信息学分析,选择可能具有重要功能的基因进行深入研究。基于生物信息学电子克隆的策略克隆基因全长,最后设计引物通过RT—PCR验证电子克隆的正确性。显微注射RNA观察KLP基因过表达对斑马鱼胚胎发育的影响,探讨KLP基因的功能。得到以下结果: 1 SEXER筛选:利用利用人脐静脉内皮细胞免疫兔血清筛选斑马鱼心脏cDNA表达文库共获得22个阳性克隆。 2基因全长的克隆及生物信息学分析:充分利用基因组学的研究成果,通过est序列拼接、基于基因组的直接测序方法等获得了斑马鱼KLP基因的完整编码区序列,随后用RT—PCR扩增目的基因并测序以验证电子克隆的正确性。 3功能的初步研究:通过生物信息学的分析预测,我们得到的KLP基因全长为5171bp,编码1574个氨基酸,该蛋白含有8个C2H2基序,与转录因子KAISO样蛋白相似性较高,提示可能为一新的转录因子,因此命名为KLP(KAISOLike Protein),但没有KAISO蛋白所有的BTB/POZ结构域,提示该蛋白功能与KAISO有所不同。KLP基因过表达观察到斑马鱼胚胎发育严重滞后及畸形,提示该基因在胚胎发育早期即具有重要的作用。 利用交叉免疫学筛选方法可以发现大量新的能引起交叉免疫反应的分子;联合采用基于基因组序列直接测序、est序列拼接的电子克隆策略和RT—PCR,成功的克隆了斑马鱼的新基因KLP,并对其功能做了初步研究
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