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黄粉虫抗冻蛋白基因的克隆与应用研究

岳昌武  
【摘要】: 现已发现多种生物具有抗冻或者抗冻相关基因,它们编码的蛋白质利用氢键与冰晶,连接阻止冰晶的进一步增长,从而降低体液的结冰点。抗冻蛋白广泛存在于不同生物体中,包括鱼类、昆虫、植物、细菌和真菌。在低温时,植物可以利用体内的一些已有蛋白质或新合成一些蛋白质,来维持正常的新陈代谢。这些植物度过低温逆境的蛋白质或多肽通称为植物低温蛋白(cold-induced proteins)。 甘薯是低温敏感植物,在10℃以下时,甘薯的细胞原生质活动停滞,生理机能受到影响,因而发生冷害。当温度在-2℃时,甘薯细胞间隙结冰,其组织被破坏,从而发生冻害。由于受冷害或冻害的薯块生理作用异常,新陈代谢受到破坏,致使薯块的贮藏性和抗病力降低,因而容易受病菌侵染。此外,在甘薯种苗生长过程中,常常因为寒潮突然降温导致冻害发生给生产带来不可估量的损失。因此,培育抗冻甘薯新品种具有重要的应用前景。 迄今已有8种黄粉虫抗冻蛋白的cDNA被鉴定,它们分别编码84、96或102个氨基酸残基。已有研究表明,黄粉虫抗冻蛋白可以使溶液的冰点降低5.58℃,是已知所有抗冻蛋白中抗冻活性最高的。 本研究从冷诱导的黄粉虫幼虫中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到一条全长为339bp的cDNA片段。该片段编码112氨基酸的包含信号肽(28个氨基酸)抗冻蛋白的完全编码区序列。该蛋白成熟区是由7个由CTXSXXCXXAXT基序构成的β-螺旋组成,富含Thr(17.55%)和Cys(18.74%),能够形成8个分子内二硫键。与Genbank上已有序列比对发现,我们克隆到的序列与已知Tmafpi4-9基因序列具有最高相似性,核酸同源性高达99%,氨基酸同源性高达96%。基因序列分析发现,与Tmafpi4-9基因相比,Tmafp1有第5位(G→C),第44位(C→T),第229位(G→A)和第318(A→T)位,共4个碱基发生变化,这种变化导致与THPi4-9相比,TmAFP1的第2位的甘氨酸残基被丙氨酸残基取代,第16位苏氨酸残基被异亮氨酸残基取代,第76位的缬氨酸残基被蛋氨酸残基取代,第107位苏氨酸残基被丝氨酸残基取。 利用Tmafp1序列构建抗冻蛋白大肠杆菌原核表达质粒载体,经IPTG诱导成功表达出预期大小的重组蛋白,该蛋白经复性、纯化后表现出了冰结合活性与体外抗冻活性。进一步利用黄粉虫抗冻蛋白代替传统抗冻保护剂DMSO制备的大肠杆菌感受态细胞实验结果表明,30μg/ml浓度下,重组抗冻蛋白制备大肠杆菌感受态细胞转化效率最高。实验结果还表明随着蛋白浓度加大(大于40μg/ml),转化效率表现降低趋势,说明抗冻蛋白的抗冻保护活性与浓度之间存在一定的负相关关系。保存时间对所制备的感受态细胞的转化效率没有太大影响。在液氮和-80℃冰箱保存条件下,感受态细胞转化效率变化不大,当保存在-20℃冰箱中时,转化效率很低。 为了解决甘薯块根保存与幼苗生长过程中冻害问题,本研究利用本实验室克隆得到的甘薯块根特异性启动子、CaMV35S启动子(组成型)、黄粉虫抗冻蛋白编码区和农杆菌质粒载体分别成功构建出了抗冻蛋白甘薯块根特异表达质粒载体和抗冻蛋白植物表达质粒载体,将分别用于甘薯块根保存期间和幼苗生长过程中的抗冻保护。目前,正利用上述两种质粒载体转化甘薯材料,以期获得抗冻甘薯材料。 植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(s-adenosylmethionine synthetase,SAMS)是植物代谢中的1个关键酶,它的表达受到比如盐胁迫、温度胁迫、渗透压胁迫等一些环境因子的诱导。本研究利用本实验室建立的甘薯冷胁迫抑制消减文库中扩增得到1个全长为1182bp的甘薯SAMS完全编码区DNA片段,该序列与其它植物sams基因的核苷酸相似性达85.48%,所推导的氨基酸序列相似性达93.6%。利用该序列构建了原核表达质粒pEF-SAMS,鉴定后转入大肠杆菌BL21,IPTG诱导后成功表达出预期大小融合蛋白质。该基因的启动子可能在甘薯抗胁迫基因工程育种方面具有重要的意义。该启动子的克隆工作正在进行。


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