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《四川大学》 2007年
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蓖麻油抗雌鼠生育作用活性物质的分离、分析及作用机理研究

张小雪  
【摘要】: 鼠害是农业生物灾害中的主要灾种之一,是当今世界性灾害,给农业、林业、畜牧业等造成了巨大的经济损失。有效控制鼠害是保障农林牧业可持续发展的关键环节。目前,国内外鼠害防治以化学防治为主,主要是通过增加鼠的死亡率来控制害鼠的种群数量,但均无持效性,且灭鼠后的低密度时间最长仅维持一年左右,此后鼠密度逐渐上升而恢复至原有水平;传统灭鼠剂还存在对环境和其它生物有毒副作用和成本高等弊端。鉴于传统灭鼠措施存在的不足,一种新的鼠害控制策略逐渐受到重视,即从保持生态平衡的角度出发,寻求一种控制鼠类出生率的植物性不育剂,通过降低鼠类群体的繁殖率而实现降低群体密度,从而达到从根本上控制鼠害的目的,且对人类和其他动物、环境安全无害,效果持久。 有关不育对鼠类种群繁殖力和数量影响的研究表明:不育能够取得灭杀的效果,若考虑不育的干扰作用,不育方法比灭杀更能控制鼠类种群数量的增加;不育控制鼠害的实验表明,雌性不育比雄性不育效果好,而双性不育比单性不育效果更好。在近年来兴起的植物不育剂的研究和开发中,许多植物源不育剂是针对抗雄鼠生育的,而抗雌鼠生育植物不育剂的研究和开发却较少见。其主要原因是在雌性不育剂有效成分的研发过程中,作为导向分离的筛选靶标较难确定,造成筛选抗雌鼠生育有效成分难度比较大。 蓖麻油是大戟科植物蓖麻(Ricinus communis L.)种子的乙醚提取物(AEC)。在我国传统医学中,蓖麻油具有泻下通滞、消除痈疽肿毒、导泻等功能;临床上用蓖麻油抄鸡蛋进行催产已有多年的历史;在印度、朝鲜、约旦等国和一些非洲国家,妇女常常服用蓖麻籽及其提取物来进行避孕。有研究表明,蓖麻油具有抗雌鼠和雄鼠生育的作用,且其抗生育活性较强。为了研制新型的鼠类不育剂,本研究对蓖麻油抗雌鼠生育作用和作用机理进行了研究,建立了抗雌鼠生育活性物质的体外筛选方法,导向分离出具有较强抗雌鼠生育活性的晶体物质,并对这一抗雌鼠生育活性晶体物质进行了分析。本论文研究的结果既为开发高效、安全的植物源抗鼠生育药物提供有效药源,又为我国蓖麻资源的综合利用开辟了新途径,有利于提高蓖麻产业经济效益与社会效益;有利于为创制与环境相容的高效植物源生物鼠不育剂、开发出具有我国自主知识产权的新型植物源农药,奠定坚实的理论基础。本论文主要研究内容和结果如下: 1、通过用蓖麻油在特定的时间内连续灌胃小鼠,统计怀孕率和胚胎数量,研究蓖麻油的抗早孕、抗着床作用。结果表明:20 mg/kg/d处理组小鼠受孕率降低不明显,但是小鼠所孕胎儿总数有一定的减少;40 mg/kg/d及其以上浓度的两个处理浓度小鼠受孕率明显降低,其生育抑制率分别达到:72.2%、88.2%和90%(与对照组比较,p0.01),个体所孕的胎儿数也明显减少;蓖麻油对小鼠的生育抑制作用有一定的量-效关系;在抗着床方面,40 mg/kg/d、80 mg/kg/d和160 mg/kg/d三个处理组的子宫内着床位点明显减少,着床率明显降低,分别为:3/8、1/6和1/6;在抗早孕方面,从40 mg/kg/d处理浓度开始,小鼠怀孕率明显降低,生育抑制率显著提高;小鼠怀孕的胎儿数随着处理浓度的增加而减少;此外,蓖麻油处理组卵巢和免疫系统主要的器官脾和肾上腺指数变化不明显,但从40 mg/kg/d处理浓度开始,小鼠胸腺增大、胸腺指数增加。随着处理浓度的加大,胸腺指数增加得越显著(p0.01)。 2、采用灌胃蓖麻油后对小鼠动情周期、血清雌二醇(E2)、孕酮(P)等性激素水平和妊娠相关蛋白-A(pregnancy-associated plasma protein A,PAPP-A)变化情况,以及蓖麻油引起的未怀孕体质健壮小鼠的卵巢、输卵管和子宫结构变化进行研究,探讨蓖麻油抗生育活性的作用机理。结果表明:20mg/kg/d剂量蓖麻油处理组小鼠动情期的时间和表现与对照组比较均无明显区别;而40mg/kg/d及其以上处理组小鼠在动情期生理特征不明显,动情期缩短,动情间期延长且不规则。小鼠血清中的雌二醇(E2)水平无明显变化,而孕酮(P)含量有一定的升高;在20 mg/kg/d处理组,小鼠血浆中的PAPP-A稍微低于对照组;而从40 mg/kg/d处理剂量开始,PAPP-A值降低显著;且随着蓖麻油处理浓度的增加,PAPP-A值降低程度增大;蓖麻油40 mg/kg/d剂量处理组和以上浓度剂量处理组膨大子宫与正常对照未孕雌鼠子宫相比,其内腔扩大,子宫壁明显变薄;肌肉层比对照组薄,肌纤维排列疏松、紊乱:子宫基质层变薄,其内腺体减少;黏膜上皮增厚。 3、通过用不同剂量蓖麻油处理原代培养大鼠蜕膜细胞和黄体细胞,观察细胞形态变化,同时用MTT法检测细胞活力,确定了蓖麻油抗雌鼠生育活性成分的作用靶标,首次建立蓖麻油抗生育有效成分的体外筛选方法。结果表明:400μg/mL及其以上浓度蓖麻油处理液对体外培养大鼠蜕膜细胞形态有明显的影响,400μg/mL蓖麻油处理液使部分离体培养蜕膜细胞体积比正常细胞明显减小、细胞内出现明显空泡,部分细胞胞浆皱缩、死亡。MTT法检测发现:400μg/mL及其以上处理浓度的蓖麻油对蜕膜细胞的生长有显著的抑制作用(p0.05);蓖麻油对蜕膜细胞的半抑制浓度(IC_(50))为568.6±5.3μg/mL,r=+0.9790;且这一抑制作用具有良好的量-效关系。而蓖麻油对黄体细胞活力的抑制作用不显著,仅仅表现在600μg/mL浓度蓖麻油处理24h的大鼠黄体细胞体积变小,细胞数量略有减少。用大鼠离体培养蜕膜细胞的活力测定方法作为蓖麻油抗雌鼠生育有效成分分离、提纯的活性跟踪指标是可行的。 4、以原代培养大鼠蜕膜细胞(DSC)活力作为筛选靶标,首次导向分离蓖麻油(AEC)中的抗生育活性成分。经过皂化、乙醚萃取、乙醇重结晶和活力检测等步骤,获得一种对大鼠蜕膜细胞活力有抑制作用的无色晶体,其半抑制浓度(IC_(50))为63.84±3.04μg/mL,r=+0.9478。GC-MS分析和计算机相似性比较表明:无色晶体由5种成分组成,其中有4种成分为植物甾醇。5种成分分别是:麦角甾-5-稀-3-醇(Ergost-5-en-3-ol),豆甾醇(Stigmasterol),v-谷甾醇(γ-Sitosterol)、岩藻甾醇(Fucosterol),和普罗布考(Probucol)类似物等。其中γ-谷甾醇(7-Sitosterol)的含量最高,达44.77%;其余组分的含量分别是:豆甾醇(Stigmasterol)占35.80%,岩藻甾醇(Fucosterol)占8.40%,麦角甾-5-稀-3-醇(Ergost-5-en-3-ol)占6.10%和普罗布考(Probucol)类似物占4.93%。根据实验结果和文献报道推测:γ-谷甾醇(7-Sitosterol)很有可能是抑制离体培养大鼠蜕膜细胞活力的主要成分;而豆甾醇(stigmasterol)可能起协助的作用。
【学位授予单位】:四川大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S482.55

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