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荧光光谱和吸收光谱法研究蓝膜和紫膜中细菌视紫红质

成兰英  
【摘要】: 紫膜在嗜盐菌(Halobacterium halobium)原生质膜上以碎片形式存在(每个碎片含10万个菌紫质分子)。细菌视紫红质(bacteriorhodopsin,BR)是紫膜中惟一的蛋白质成分,由248个氨基酸和1个视黄醛分子组成,并通过7个α螺旋结构跨膜整合在细胞膜中,分子量26KD。BR中含有8个色氨酸(Trp)和11个酪氨酸(Tyr),具有光驱动质子泵、光循环和光电响应功能。紫膜在pH≈2下或者去除紫膜表面的二价金属离子(Ca~(2+)和Mg~(2+))后变成蓝膜,不能进行光循环,也没有质子泵功能。人们对紫膜中BR分子的结构、光循环和光致变色效应已经有了较深入的认识,开始探索把这种生物分子材料应用于光电探测、人工神经网络、光学信息存储与处理、生物芯片等方面。到目前为止,采用荧光光谱和吸收光谱方法对蓝膜和紫膜中BR蛋白质进行研究的报道不多。本试验利用荧光光谱和吸收光谱等方法,比较在室温下蓝膜和紫膜中BR蛋白质溶液构象的差异以及温度对构象改变的影响。试验结果如下: 1.吸收光谱研究发现,在室温下,蓝膜中视黄醛的特征峰是605nm,紫膜光适应状态中视黄醛的特征峰是570nm,紫膜暗适应状态中视黄醛的特征峰是560nm,蓝膜视黄醛区域峰形不同于紫膜的。四阶微分紫外吸收光谱研究发现,蓝膜BR蛋白质的特征峰相对于紫膜的稍有蓝移。更有意思的是,吸收光谱研究中我们发现,随着温度的升高,蓝膜中视黄醛的605nm特征峰光吸收降低,在65-75℃的狭窄温度范围内,此特征峰光吸收随着温度急剧降低,几近消失。与此同时,在380 nm处却出现一吸收峰,表明蓝膜中视黄醛的局部构象与温度有关,这一现象以前未曾有过报道。并且蓝膜BR蛋白质受温度影响的过程是不可逆的。与此不同的是,随着温度的升高,在紫膜中只能观察到视黄醛的570nm特征峰光吸收的降低。 2.内源荧光研究发现,在室温下,蓝膜和紫膜中BR蛋白质的最大激发波长都在280nm。蓝膜和紫膜BR蛋白质中色氨酸荧光的最大发射波长都在340nm左右,但在蓝膜中BR蛋白质的荧光效率比紫膜的高出1.4倍。蓝膜和紫膜BR蛋白质在280nm激发下最大发射波长分别是331nm和326nm,内源荧光是色氨酸和酪氨酸的共同贡献,并且紫膜中酪氨酸对荧光的贡献更大。荧光研究中我们发现,随着温度上升,蓝膜中BR蛋白质内源荧光强度减小,而紫膜中BR蛋白质内源荧光强度明显增强。研究还发现,随着温度上升,蓝膜和紫膜中色氨酸的荧光最大发射波长仅有微小红移,在100℃时,最大发射波长才红移至346nm,表明BR蛋白质只发生了部分去折叠,也表明蓝膜和紫膜中BR蛋白质热稳定性相当高。 3.外源荧光探针bis-ANS的研究表明,蓝膜中BR蛋白质可结合bis-ANS,其解离平衡常数为12.21μmol/L,蓝膜BR蛋白质表面存在可结合bis-ANS的疏水性区域,而紫膜中BR蛋白质则几乎不能结合bis-ANS。表明蓝膜和紫膜中BR蛋白质表面疏水性不同。随着温度上升,蓝膜中BR蛋白质结合的bis-ANS荧光蓝移,同时荧光强度明显增强(尤其是60-75℃更明显)。在25℃、65℃、80℃、90℃时,蓝膜中BR蛋白质结合荧光探针bis-ANS的解离平衡常数K_d分别为12.21、5.22、6.42、7.09μmol/L。在不同温度下,蓝膜BR蛋白质与bis-ANS都只有一个结合位点。 4.通过荧光光谱、吸收光谱和停流技术对酸化紫膜转变成蓝膜变化过程的跟踪研究表明,视黄醛特征峰的递变(570→605nm)以及蛋白质荧光最大发射波长的递变(326→331nm)都是在狭窄的HCl浓度范围(11.5-13.3mmol/L)内同步进行的,该转变过程在0-2s之内极快完成。 5.高压力试验结果显示,当压力增加至260MPa,蓝膜和紫膜BR蛋白质的荧光光谱没有发生变化。蓝膜和紫膜BR蛋白质溶液中加入盐酸胍浓度达到8mol/L也没有变性,再采用260MPa的高压力试验其荧光光谱仍然没有发生变化。表明蓝膜和紫膜BR蛋白质对高压力和变性剂都有很好的耐受性。 我们从BR蛋白质内源荧光、与外源荧光探针的结合、吸收光谱以及它们受温度的影响等不同角度研究都表明,蓝膜和紫膜BR蛋白质溶液构象存在着明显不同。紫膜BR蛋白质表面除去二价金属离子转变成蓝膜的过程,不仅影响生色团视黄醛的状态,同样也引起色氨酸和酪氨酸残基所处微环境的变化以及蛋白质表面区域疏水性的变化。换句话说,紫膜转变为蓝膜,BR蛋白质构象发生了根本的改变。


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