转C_4光合酶基因水稻的光合特性及生理机制研究

【摘要】： 高等植物在光合类型上可分为C_3、C_4、CAM三大类。C_4和CAM植物是在逆境条件下经过长期驯化，从C_3植物进化而来的。与C_3植物相比，C_4植物由于具有CO_2浓缩机制，能在高光强、高温及低浓度CO_2、干旱等条件下，比C_3植物有较高的光合速率和营养、水分利用效率。二十世纪末，随着转基因技术的快速发展，以农杆菌为介导已成功地将来自玉米编码C_4光合途径关键酶PEPC，PPDK，NADP-ME的基因分别转入水稻中，获得了不同的高表达的转基因水稻材料。通过对C_4途径有关光合酶活性、光合作用对光的响应和光抑制／光氧化条件下的叶绿素荧光特性等生理指标的比较，研究了转C_4光合酶基因水稻的生理特性。转C_4光合酶基因水稻中，其相应的酶活性确实得到了高表达。转PPDK、PEPC光合酶基因水稻的饱和光合速率比原种高，其中转PEPC基因水稻的光饱和点比原种高200μmol m~(-2)s~(-1)，饱和光合速率比原种高53．1％；而转ME基因水稻的饱和光合速率略低于原种。在高光强(3h)或光氧化剂甲基紫精(MV)处理后，与原种相比，转PEPC酶基因水稻的PSⅡ光化学效率(F_v／F_m)、实际光化学效率(FPSⅡ)和光化学猝灭(q~P)下降得较少，证明其耐光抑制和耐光氧化能力增强。而转ME基因水稻的F_v／F_m、F PSⅡ和q~P下降的幅度高于原种，表明其易遭受光抑制和光氧化伤害。 进一步用杂交的方法将ME基因转入PEPC+PPDK双基因水稻，测定了不同转C_4光合酶基因水稻的C_4光合酶活性、光合速率以及活性氧代谢有关指标，发现原种中具有全套的C_4光合酶，但活性很低，而不同转C_4光合酶基因水稻高表达了相应的C_4酶活性。在高光条件下，与原种相比较，转PPDK基因水稻的光合速率未增加；转ME基因水稻的光合速率降低了7．6％；转PEPC基因水稻的光合速率增加了52．1％，转PEPC+PPDK双基因水稻与转PEPC基因水稻相近。ATP处理后，可显著提高转PEPC+PPDK双基因水稻和转PEPC+PPDK+ME基因水稻的光合放氧速率，后者达到玉米的82％，显现出类似C_4的光合特点，表明ATP是构建C_4水稻的关键因子。光氧化条件下，转PEPC+PPDK+ME基因水稻的耐光氧化能力得到进一步的增强。 对不同转C_4光合酶基因水稻的生理特性研究，发现转PEPC基因水稻显著地增加光合能力。本文进一步研究转PEPC基因水稻的光合保护能力，看到玉米PEPC基因导入水稻后，在高光强下光合速率提高50％，光合作用的光抑制减轻。用PEPC的专一抑制剂证明光合的增加确实是与PEPC基因的导入有关。不同基因型水稻在高光高温自然条件下中午均有光抑制现象，其中转PEPC基因水稻中午F_v／F_m降低较少，光抑制较轻，光能转化为化学能的效率较高，热耗散较低。 继续将转PEPC基因水稻经过世代繁殖，逐代检测、选择，得到第8代稳定的种质。通过测定运用稳定和放射性碳同位素、光合速率和荧光特性，结果表明该种质为C_3植物，但C_4原初光合产物增多，表现出C_4光合特性有所改善；转PEPC基因水稻是具高光效、耐光氧化并且其优良的光合特性能稳定遗传的种质，为我国的高光效育种提供了一个新的种质资源。 以转PEPC基因水稻种质为父本，与粳稻9516杂交得到F_1代，再进行花粉培养，经过光合及酶活性筛选后，再经过4年的定向筛选和监测，得到稳定的花粉株系JAAS45。通过对JAAS45与亲本不同生育期的光合色素含量、净光合速率和水分利用效率的研究，发现JAAS45随着发育阶段的推进，到分蘖期以后，JAAS45的单位叶面积Ch1和Car含量超过9516，并一直维持着较高水平，与PC相近。JAAS45苗期的净光合速率(Pn)与9516相近，而到了分蘖期，其Pn超过了9516，尤其到了抽穗及灌浆期其Pn还超过了PC。从苗期到抽穗期，JAAS45的水分利用效率(WUE)明显高于9516，与PC相接近。说明JAAS45已与父本PC接近，不仅有较高的Pn和较强的抗光抑制能力，而且还能充分利用早晨和傍晚较弱的光强进行光合作用。此外，JAAS45在生长发育期具有较高的WUE，有利于节约农业用水。 另外，JAAS45抗光氧化研究发现，光氧化处理后，与其母本9516相比，JAAS45的F_v／F_m、FPSⅡ和q~P下降的较少，而q~N增加的较多，说明在光氧化条件下，JAAS45吸收的光能中有较多的光能转化为化学能，过剩的光能通过热耗散而减轻光破坏；同时JAAS45的内源活性氧清除酶系超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)诱导的活性高于母本9516，从而有效清除水稻叶片内的活性氧O_2~T，使活性氧积累较少，因而膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)产生较少，表明JAAS45耐光氧化能力较强。在光氧化条件下，JAAS45的叶绿素和蛋白质含量比9516下降较少，与父本相接近，表现出耐光氧化特性。 对JAAS45及父母本进行PCR检测和PEPC酶活性的测定，并测定叶片CO_2交换和荧光指标，显示父本的PEPC基因能稳定传递和遗传到杂交后代JAAS45中，且JAAS45具PEPC高表达的特性，在光合特性上表现有较多的饱和光合速率、量子效率、F_v／F_m、q~P和非光化学淬灭(q~N)，具耐光抑制和光氧化的特性。用饲喂C_4光合原初产物OAA、MA和PEP，证明它具有有限的C_4光合微循环。该研究阐明了转PEPC基因水稻的生理遗传特点，为常规育种和生物技术的结合育种途径提供了依据。

【关键词】：转基因水稻 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC) 丙酮酸磷酸二激酶(PPDK) NADP-苹果酸酶(NADP-ME) 光合特性 叶绿素荧光 光抑制 光氧化 杂交后代 花粉培育
【学位授予单位】：四川大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S511
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