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《重庆大学》 2011年
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光合细菌Rhodobacter sphaeroides新型异源蛋白表达体系的构建及其应用研究

赵志平  
【摘要】:大肠杆菌和酵母是目前最常用的表达系统,广泛用于生产具有重要生物学功能的重组蛋白。但是,利用当前商业化的表达系统生产重组蛋白时,都不能在提取前快速、实时地检测其表达水平。 类球红光合细菌Rhodobacter sphaeroides全基因组测序已经完成,是研究细菌光合作用和膜蛋白形成的模式生物。在合适的生长条件下,Rb. sphaeroides细胞质膜(CM)会自动内嵌形成胞质内膜系统(ICM),同时捕光色素蛋白复合体2(LH2)和LH1以及光化学反应中心(RC)得到大量表达,它们的含量可超过总膜蛋白的50%。其中,LH2由9对α-亚基和β-亚基组成,分别由puc1BAC操纵子的puc1A和puc1B编码。研究发现,该细菌中还有第二个puc操纵子puc2BA,也参与LH2的合成。LH2在~800 nm和~850 nm处有最大特征光谱吸收,LH2的表达量越高,特征光谱吸收峰值越大。因此,当异源蛋白和LH2的α-亚基或β-亚基组成融合蛋白后,便可以在提取前通过分析寄主细菌培养液在~800 nm和~850 nm处的光谱吸收而快速实时地检测重组蛋白的表达水平。 本研究以Rb. sphaeroides DD13突变株(基因组缺失puc1BA和pufBALMX,缺少LH1、LH2和RC)为出发菌株,通过同源重组技术,敲除第二个puc操纵子puc2BA获得了突变体Rb. sphaeroides CQU68 (基因组缺失puc1BA和pufBALMX,puc2BA);利用大肠杆菌乳糖操纵子基因lacIq和lacO及Rb. sphaeroides puc1BAC操纵子的启动子pucP构建了杂合启动子lacIq-pucP-lacO,并运用该启动子及LH2β-亚基和α-亚基构建了适合于Rb. sphaeroides表达异源融合蛋白的表达载体pRKlacIqpucPpuc1BHis101AC;通过His-tag标签建立了亲和层析一步法快速纯化LH2及LH2β-亚基融合蛋白的方法体系。利用CQU68突变体及上述表达载体表达了LH2β-亚基-GFP和LH2β-亚基-HNP3融合蛋白。光谱吸收分析、SDS-PAGE和Western blotting结果表明,LH2β-亚基融合蛋白在~800 nm和~850 nm处的特征光谱吸收可以作为快速实时检测融合蛋白表达水平的指标。 本文取得的主要结论如下: 1、杂合启动子lacIq-pucP-lacO的构建实现了LH2和LH2β-亚基融合蛋白表达的人为控制,它们的表达受氧气浓度和IPTG的严格调控。只有在较低的氧气浓度(半好氧)并添加IPTG诱导的情况下,LH2及LH2β-亚基融合蛋白才能表达;IPTG最佳使用浓度为1 mM。 2、利用His-tag标签通过亲和层析实现了LH2及LH2β-亚基融合蛋白的一步法快速纯化。纯化的LH2及LH2β-亚基融合蛋白仍结合着大量的细菌叶绿素和类胡萝卜素,具有良好的电子传递活性。与传统的蔗糖密度梯度离心法相比,该方法体系大大简化了LH2和LH2β-亚基融合蛋白的纯化过程。 3、利用Rb. sphaeroides CQU68突变体成功表达了LH2β-亚基-GFP和LH2β-亚基-HNP3融合蛋白。融合蛋白表达后能够伴随着标签蛋白LH2β-亚基进入ICM,在~800 nm和~850 nm处有LH2特异的光谱吸收。光谱吸收、SDS-PAGE和Western blotting结果表明细菌培养液在~800 nm和~850 nm处的特征光谱吸收峰值越高,则LH2β-亚基融合蛋白的表达量越大。因此,在LH2β-亚基融合蛋白工程菌株培养过程中,可以利用其培养液在~800 nm和~850 nm处的特征光谱吸收峰实时快速地检测融合蛋白表达的水平。 本文利用光合细菌Rb. sphaeroides构建了一种全新的、可严格调控并能快速实时检测重组蛋白表达水平的体系,在异源蛋白表达及功能研究领域,具有广阔的应用前景。
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