京尼平苷调节INS-1细胞胰岛素分泌的分子机制研究

【摘要】：2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一种常见的代谢性疾病,其主要特点是胰岛素抵抗和胰腺β细胞功能下降或数量减少导致的胰岛素分泌相对不足。近年来,基于肠促胰素(Incretin)的治疗是2型糖尿病治疗领域的研究热点,其中的代表就是肠道L细胞分泌的胰高血糖素样肽-1 (Glucagon-like peptide-1, GLP-1)。GLP-1通过激活其受体来促进胰岛素分泌、提高胰岛素合成、刺激胰岛β细胞增殖、阻止其凋亡。但是内源性的GLP-1在体内很快被二肽基肽酶-IV (Dipeptidyl peptidase IV, DPP-IV)降解,其半衰期非常短,只有1～2分钟,皮下注射后,只有10 %生物活性的GLP-1到达血浆,极大的限制了其临床应用。因此,筛选并研究GLP-1受体小分子激动剂对于治疗2型糖尿病具有十分重要的意义。 在前期工作中,我们发现传统中药栀子的主要活性成分——京尼平苷(Geniposide)是一种新型的GLP-1受体的激动剂,它可通过激活GLP-1受体表现出神经营养和神经保护作用;尤其重要的是,在链尿佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的2型糖尿病大鼠模型上研究发现,京尼平苷具有降低血糖水平、调节胰岛素分泌、改善糖尿病大鼠的胰岛素抵抗的作用。这些结果都提示,京尼平苷可能是一个治疗2型糖尿病的先导化合物。但是,对于京尼平苷如何调节胰岛素分泌及其作用机制还不清楚。本研究将前期研究基础上,探讨京尼平苷对胰腺β细胞系INS-1细胞胰岛素分泌的影响,探索GLP-1受体与京尼平苷调节胰岛素水平的相关性及其细胞信号转导途径,为京尼平苷的临床应用提供实验依据。 利用ELISA方法,本文首先考察了京尼平苷对INS-1细胞胰岛素分泌的影响,结果发现,京尼平苷可直接诱导INS-1细胞分泌胰岛素,而且在中低浓度(5.5、11、16.7 mM)的葡萄糖存在条件下,京尼平苷可明显促进β细胞对葡萄糖的吸收、利用和ATP产生,增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌。 其次,本文还分析了GLP-1受体与京尼平苷调节胰岛素水平的相关性。实验结果证实,在预先用GLP-1受体拮抗剂exendin (9-39)孵育细胞后,京尼平苷对INS-1细胞中葡萄糖诱导的胰岛素分泌的调节作用被明显抑制;与此同时,我们还利用分子生物学技术,设计并构建了GLP-1受体基因的siRNA干扰质粒,并对干扰效率进行了分析、比较,建立了GLP-1R干扰的INS-1细胞株。结果发现,在GLP-1R干扰的INS-1细胞中,京尼平苷对葡萄糖诱导的胰岛素分泌的调节作用也被明显抑制。上述实验结果表明,GLP-1受体在京尼平苷调节胰岛β细胞的胰岛素分泌的过程中有重要作用。 然后,利用激酶抑制剂阻断的方法,对京尼平苷调节胰岛素分泌的细胞信号转导机制进行了初步研究。实验结果发现,预先用PI3K激酶抑制剂LY294002和EGFR阻断剂AG1478孵育INS-1细胞30分钟,可明显抑制京尼平苷对葡萄糖刺激的胰岛素分泌的调节作用,表明京尼平苷调节胰岛素分泌可能与这些激酶途径有关。Western blot实验结果也表明,京尼平苷可调节INS-1细胞中PI3K信号通路中PDK1、PKB/Akt磷酸化水平,PI3K抑制剂LY294002能明显抑制京尼平苷诱导的INS-1细胞中PDK1和Akt磷酸化,证明京尼平苷调节葡萄糖诱导的β细胞胰岛素分泌可能与其调节PI3K信号通路中关键蛋白PDK1、PKB/Akt的磷酸化有关。 本文还在此基础上考察了京尼平苷对PI3K信号通路下游与胰岛素分泌密切相关的效应分子的影响。实验证实,京尼平苷能够增强FoxO1磷酸化,促进磷酸化的FoxO1从核内排出,进而调节下游相关基因的表达。进一步研究发现,PI3K抑制剂和EGFR阻断剂都能明显阻断京尼平苷对FoxO1磷酸化。相反的,京尼平苷却明显抑制GSK3β磷酸化,而且PI3K抑制剂能明显阻断京尼平苷的这种抑制作用。提示FoxO1和GSK3β都有可能参与了京尼平苷对葡萄糖诱导的INS-1细胞胰岛素分泌的调节作用,并且经由了PI3K和EGFR信号通路。 最后,在对转录调控因子PDX-1的研究中,我们发现,京尼平苷促进PDX1从细胞浆向细胞核转运,促使下游的GLUT2蛋白表达增加。而且这种作用能被PI3K激酶抑制剂LY294002和EGFR阻断剂AG1478抑制。提示,京尼平苷可能通过PI3K信号通路调节转录因子PDX-1细胞内的转运,促使下游与胰岛素分泌相关的蛋白表达增加。 本文研究结果表明,京尼平苷通过激活GLP-1受体,能直接或在中低浓度葡萄糖存在的条件下促进胰岛素释放。其细胞信号转导途径为激活GLP-1受体后,间接调节EGFR活性,进一步磷酸化PI3K信号途径,进而抑制GSK3β及FoxO1的活性,促使转录因子PDX1从胞浆转运到胞核,调节下游与胰岛素分泌相关的蛋白表达增加。

【关键词】：京尼平苷 葡萄糖诱导的胰岛素分泌 胰高血糖素样肽1受体 分子机制
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R96
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