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《重庆大学》 2012年
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动物衣原体分子检测方法研究和诊断试剂盒的研制及应用

李应国  
【摘要】:衣原体病是由各类衣原体感染人类、哺乳动物、禽类以及节肢昆虫所引起的一类重要疾病,有些衣原体病为人畜共患传染病。衣原体革兰氏染色阴性,严格细胞内寄生。目前,衣原体科分为衣原体和嗜衣原体两个属。衣原体属包括沙眼衣原体、鼠衣原体、猪衣原体;嗜衣原体属包括肺炎嗜衣原体、家畜嗜衣原体、鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体、豚鼠嗜衣原体和猫嗜衣原体。衣原体引起人类和动物多种疾病,沙眼衣原体、肺炎嗜衣原体和鹦鹉热嗜衣原体感染人类及各种动物;家畜嗜衣原体、流产嗜衣原体和猪衣原体主要感染家畜和某些野生动物。因此,本病具有十分重要的公共卫生和经济意义,建立快速准确的鉴别诊断方法对衣原体病预防和控制尤为重要。 本论文基于衣原体的主要外膜蛋白基因(ompA)开发针对猪衣原体(C.suis)、流产嗜衣原体(Ch.abortus)及肺炎嗜衣原体(Cpn)的多重套式PCR(nested multiplexpolymerase chain reaction assay,nmPCR)检测方法及试剂盒,衣原体荧光定量PCR检测方法和LAMP检测方法。并应用nmPCR试剂盒对青海某羊场和重庆地区种猪场进行了衣原体病的流行病学研究。获得以下研究结果: (1)本文建立了衣原体科特异PCR检测方法以及流产嗜衣原体、猪衣原体和肺炎嗜衣原体的单管同步分型的多重套式PCR(nmPCR)检测方法。在nmPCR首轮扩增中,可以扩增出衣原体科特异性的1100bp核酸片段。在此基础上,第二轮nmPCR扩增获得种特异性扩增片段:流产嗜衣原体340bp,猪衣原体526bp和肺炎嗜衣原体267bp。该方法具有灵敏度高和特异性的特点,与改良DNA提取方法相结合,可以有效实现对细胞培养物、猪、绵羊和山羊鼻咽拭子、粪拭子及组织样品中三种衣原体同时进行检测。 (2)本文研发了与猪衣原体、流产嗜衣原体及肺炎嗜衣原体的单管同步分型的多重套式PCR检测方法相匹配的标准化检测试剂。通过稳定性试验和实验室间验证试验,证明了该检测试剂盒具有良好稳定性和可重复性。 (3)本研究建立了衣原体的实时定量PCR检测方法,灵敏度高,特异性强。最低可以检测200拷贝/μL质粒DNA,可用于衣原体的诊断和流行病学调查。 (4)本文基于ompA基因,建立了衣原体科LAMP检测方法。该方法具有特异性强、灵敏度高及实验条件要求较低的特点,可以在水浴锅中完成,在添加了钙黄绿素后,阳性的LAMP扩增反应呈现明显的黄绿色,使检测结果的非常直观,容易判读。本法适宜于临床上对衣原体病进行现场快速筛查,但阳性样品可用其他方法进行分型确证。 (5)应用本文研发的猪衣原体、流产嗜衣原体及肺炎嗜衣原体的单管同步分型的多重套式PCR检测试剂盒对青海羊场和重庆猪场采集的样品进行检测。首次从猪检测到C.suis和Cpn,首次从我国绵羊和山羊检出C.suis和Cpn,并发现C.suis、Cpn和Ch.abortus对绵羊和山羊的混合感染。
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S855

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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中国期刊全文数据库 前10条
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