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《重庆大学》 2013年
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PPARs筛选模型的构建及抗糖尿病天然药物活性成分的筛选

林叶新  
【摘要】:过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators activated receptor,PPAR)与糖尿病等代谢疾病在内的慢性疾病密切相关。现有的PPARs激动剂包括天然激动剂和合成激动剂。由于人工合成的激动剂,尤其是单靶点的PPARγ配体药物,不断显现出严重的毒副作用,现急需寻找低毒、高效的PPARs泛激动剂。而天然药物尤其是中药,多年来都发挥着治疗和预防疾病的重要作用,且具有可长期服用的特点,使得从天然药物中筛选新型的PPARs泛激动剂,成为开发治疗糖尿病及其相关并发症药物的研究热点。 本研究以PPARα, PPARβ和PPARγ作为靶点,首次从12种具有治疗糖尿病作用的天然药物中,筛选出了PPARs活性部位及成分,是对其药物作用机理的补充和阐明,为这些天然药物的现代化发展,及糖尿病新药的研制奠定了基础。 首先,为能有效的从天然药物中筛选出PPARs激动剂,在细胞水平上建立了以PPARα, PPARβ或PPARγ为靶点的高通量筛选模型。将重组质粒pBIND-PPAR(α、β或γ)-LBD与报告基因pGL4.35,共同转入HeLa细胞中,以PPARs的激动剂作为阳性对照(PPARα:非诺贝特;PPARβ:L165041;PPARγ:罗格列酮),通过测定荧光酶素的表达率,确定了PPARs筛选实验的条件。同时,首次引入Z′-因子对以PPARα, PPARβ或PPARγ为靶点的细胞模型进行评价。证实本研究在HeLa细胞上,构建了一种简单、稳定、有效的和多靶点的高通量筛选模型,可用于筛选PPARs泛激动剂、双激动剂或单激动剂。 接着,制备天然药物的提取物。用不同极性的溶剂,正己烷、70%乙醇、乙酸乙酯和蒸馏水为溶剂,依次对12种具有治疗糖尿病作用的天然药物(川黄连、女贞子、猪牙皂、广西山楂、石斛、桑叶、丹参、泽泻、林檎叶、绿萝花、翼首草和灰兜巴)进行全成分提取,最终获得58个提取物。 为明确这12种天然药物的PPARs活性部位,用构建好的PPARs高通量筛选模型,对58个提取物先开展了PPARγ和PPARβ的活性筛选试验。证实12种药物的提取物中,只有泽泻对PPARγ或PPARβ均无激活作用;而58个提取物中共有26个提取物对PPARγ和PPARβ同时具有激活作用。其中有3个提取物,即绿萝花的乙酸乙酯萃取物(EB1)和正己烷提取物(EA)、翼首草的EA,在测试的浓度范围内,对PPARγ和PPARβ的最高激活倍数,均高于阳性对照的激活能力。 根据上述活性实验结果,对其中10个具有PPARγ/β高活性的提取物,进一步开展PPARα活性实验,以期找到PPARs泛激动部位。结果表明,这10个提取物对PPARα均有激活作用,激活能力的强弱顺序为(相对于同批次阳性药的比值):翼首草EA>绿萝花EB1>猪牙皂EB1>绿萝花EA>林檎叶水提物上清液部分(EC)>翼首草EB3>翼首草EB1>林檎叶EB1>翼首草EC>川黄连EB1。这5种天然药物很可能是通过激活PPARs来发挥降糖、降脂和抗炎作用的。在此,本研究首次发现,天然药物的大极性提取物,即林檎叶的EC部分对PPARβ和PPARα;翼首草的EC对PPARγ和PPARα,具有明显的激活作用,激活倍数甚至高于同批次的阳性药物。 然后,为确定PPARs高活性提取物中是否含有PPARs泛激动剂,对部分二级组分和单体化合物进行了活性实验。结果表明:(1)从绿萝花EB1中获得的11个二级组分,均能激活PPARγ和PPARβ;(2)首次发现,来自绿萝花EB1的9个单体化合物中,伞形花内酯和十五烷酸对PPARγ和PPARβ同时表现出激活作用,最高激活倍数分别是1.78倍和1.92倍,及1.74倍和5.91倍;(3)首次在细胞水平上证实,小檗碱是PPARs的泛激动剂; 最后,对具有PPARs活性的10个提取物、绿萝花EB1的11个二级组分,及3个单体化合物的细胞毒性进行了初步探讨。MTT实验结果表明,有5个提取物(绿萝花的EA和EB1、翼首草的EB3、林檎叶的EC和猪牙皂的EB1),以及绿萝花EB1的11个二级组分和单体化合物(伞形花内酯和十五烷酸)在获得PPARs最高激活倍数下的作用浓度,均不会抑制ECV-304细胞和RAW264.7细胞的增殖;另外5个提取物,除了翼首草的EA部分和黄连的EB1部分,其他3个活性部位(林檎叶EB1、翼首草的EB1和EC)对这两种细胞增殖的抑制率均低于30.0%;小檗碱对这两种细胞的抑制率则分别为21.9%和31.3%。 综上所述,本文在HeLa细胞上构建了一种以PPARα/β/γ为靶点的高通量筛选模型,能有效地从成分复杂的天然药物中筛选和评价出具有PPARs活性的部位及单体化合物。为开发可用于治疗糖尿病及其并发症的新型、安全和高效的天然药物提供了理论和实验依据。
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:TQ460.1

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