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《重庆大学》 2017年
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基于荧光标记的致病菌快速检测及细菌与细胞相互作用研究

车玉兰  
【摘要】:食源性致病菌易通过食品流通环节感染人群,致病菌的高效检测是食品安全重要保证。此外,细菌感染治疗中耐药菌的出现使新型抗菌药物的需求日益迫切。面对食源性致病菌检测中背景基质复杂、检测时间长、细菌含量少的特点,以及新型抗细菌感染药物研究中药物作用效果检测方法耗时、操作复杂,不能快速筛选等问题。本文基于荧光标记检测灵敏度高、选择性好等优势,提出了样本基质干扰小、不受多余标记试剂影响的结合磁分离富集与荧光标记的细菌荧光检测法和集磁捕获、荧光标记和检测一体的快速细菌微流控芯片检测法。在对细菌荧光探针和标记模式研究基础上,将荧光标记检测技术用于细菌感染细胞作用研究,实现群体感应抑制剂作用效果快速、高效检测。相关研究为复杂食品样本中低含量细菌的快速检测提供新方法,为新型抗菌药物筛选研究提供新途径和新思路,对食品安全及致病菌的监管和感染治疗有重要研究价值和应用潜力。本文的主要研究工作及结果如下:(1)将纳米磁珠富集和聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)凝胶层析分离结合,采用荧光标记的检测模式,建立了一种食品中致病菌的快速灵敏分析方法。采用Fe3O4@SiO2-NH2通过静电作用捕获大肠杆菌,减少食品样本带来的复杂基质干扰,对大肠杆菌进行富集;荧光产率高、标记快速的吖啶橙标记后,利用PEG凝胶层析,有效去除其中残余纳米磁珠及多余荧光试剂;通过对PEG分离管底部浓缩的纳米磁珠及目标细菌复合物的目视观测,即可对含菌量高于100 cfu·m L-1的样本进行半定量初判,进一步检测分离物的荧光信号,对目标细菌含量进行定量分析。以大肠杆菌为例,检测的线性范围102-106 cfu·mL-1,检测限为100 cfu·mL-1,检测时间80 min。对超市取样的熟肉制品样本测试,本方法结果与传统的平板计数法结果吻合。(2)基于多通道微流控芯片建立了细菌磁捕获富集和原位荧光定量检测新方法。设计的芯片集成含混合区和检测区的6条微通道,磁标记的细菌在混合区与吖啶橙充分混合进行标记,检测区通过外置磁铁进行细菌的捕获富集,采用搭建的小型荧光仪对检测区捕获的细菌进行荧光强度检测。该方法对大肠杆菌的检测限为100 cfu·mL-1,检测时间50 min,荧光信号与菌液浓度在102-106 cfu·m L-1范围有良好的线性关系,可同时进行6个样本测试。(3)设计制备了多功能的适配体修饰的磁性碳量子点,同时实现对沙门氏菌的特异性磁分离捕获和荧光标记检测,建立了选择性好、背景干扰小的沙门氏菌快速荧光检测方法。将碳量子点共价结合到的Fe3O4@SiO2-NH2表面制备磁性碳量子点Fe3O4@CQDs,在其表面修饰适配体制备Fe3O4@CQDs-Apt以实现目标菌特异性标记,Fe3O4@CQDs-Apt标记沙门氏菌后发生团聚导致荧光强度降低,荧光强度的变化值与沙门氏菌在103~106 cfu·mL-1浓度范围呈现良好的线性关系,在牛奶和鸡肉的沙门氏菌合成样本中检出限为103 cfu·mL-1,检测时间60 min,可用于复杂背景基质的样本中目标菌的分离捕获及快速荧光检测。(4)采用碳量子点标记的细菌与细胞相互作用,建立细菌群体感应抑制剂对细菌感染细胞作用效果荧光检测方法,对药物作用进行快速判断和评估。以公认群体感应抑制剂呋喃酮C30为阳性对照物,对单宁酸、厚朴酚、山奈酚对沙门氏菌感染HT-29细胞作用效果进行荧光检测。结果显示:药物对沙门氏菌黏附HT-29细胞的抑制作用呋喃酮C30厚朴酚单宁酸山奈酚,侵染抑制作用呋喃酮C30单宁酸厚朴酚山奈酚。此外,对几种药物的群体感应抑制作用进行分析,几种药物均对AHL调控的群体感应有抑制。细菌运动性结果显示几种药物均能抑制沙门氏菌的Swarming,厚朴酚能抑制Swimming,表明药物通过抑制沙门氏菌群体感应及运动性抑制其对细胞的感染,建立的荧光检测方为新型细菌感染药物筛选研究提供新途径。
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R446.5

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