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重组人白介素-2(IL—2)突变体克隆及在巴斯德毕赤酵母系统中的表达与纯化

刘堰  
【摘要】:白细胞介素(2(IL(2)最初曾被称为T细胞生长因子,并能促使各种造血细胞增殖和分化。临床研究表明其关键作用可作为T淋巴细胞激活的增殖信号,因而将IL(2用于治疗艾滋病。基于其能刺激具有细胞毒的,抗肿瘤细胞的能力,IL(2还用于各种癌症的治疗。目前人IL(2已经完全用基因工程的方法生产,而且基因工程IL(2与天然IL(2的功能和临床效果基本一致。 目的:近年来,虽然基因工程IL(2应用于肝炎及某些癌症的治疗已取得令人瞩目的成果,但大剂量,长时间用药对病人仍然存在一定的毒副作用,如发热,寒战,恶心,呕吐,头晕,乏力和毛细血管渗漏综合症等,所以,为了提高人重组白细胞介素-2的稳定性和活性以及减少毒副作用,有必要定向改造rhIL-2的分子结构。本研究在毕赤酵母中高效表达hIL-2cDNA,获得hIL-2蛋白,拟对天然型hIL-2进行改构以获得新的突变体,同时进行活性测定,以便深入了解hIL-2的结构与功能的关系。方法:用PCR法从白细胞介素-2(IL-2)cDNA全序列中扩增成熟的肽基因片段,并利用定点突变技术将人重组白细胞介素-2第125位游离的半胱氨酸编码序列突变为丙氨酸序列;编码18 位亮氨酸的序列突变为蛋氨酸序列;编码19位亮氨酸的序列突变为丝氨酸序列,经限制酶酶切片段分析与DNA序列分析证明后,获得三突变体MvhIL-2。IL(2基因片段与酵母中间载体pPIC9K融合后,转化到大肠杆菌TOP10F',扩增质粒,获取大量pPIC9K-MvhIL-2DNA后,再转化毕赤酵母,并在毕赤酵母中表达突变蛋白(IL(2-C125A/L18M/L19S)。利用IL(2依赖细胞株CTLL-2细胞对纯化的突变蛋白(IL-2-C125A/L18M/L19S)和野生型IL(2进行测活。结果:本研究成功地构建IL(2突变体,并在毕赤酵母中得到表达。作为一种真核生物,毕赤酵母比起其它更高级的真核细胞表达系统来说有许多优点:例如在蛋白加工,蛋白折叠和转录后修饰等方面,同时,它又和大肠杆菌或啤酒酵母一样具有分子水平和基因水平操作容易的优点,比其它真核细胞表达系统如杆状病毒或哺乳动物组织培养更快,更容易,消耗更少,而且表达水平高,有10倍到100倍表达异源蛋白的能力。这些特点使毕赤酵母作为蛋白表达系统非常有用。将pPIC9K-MvhIL-2DNA用SalI酶切后,转入真核表达系统?毕赤氏酵母得到的转化子经摇瓶发酵,上清液用15%SDS-PAGE检测表明有IL(2突变体的表达;经Western-blot检测有免疫活性。经超滤浓缩,强阳离子交换S柱和分子筛层析得到纯化的MvhIL-2。纯化的突变蛋白对CTLL-2细胞具有刺激性;与野生型IL-2相比,在各种温度条件下储存的突变蛋白保留有更高的活性;pPIC9KMvIL-2整合到毕赤酵母中表达量占菌体总蛋白的30%以上,高表达得到的 WP=5 IL-2具有高活性。结论:人IL-2cDNA可通过PCR 技术进行定点突变,所获得的突变型MvIL-2 活性比天然型NhIL-2高5倍。所以IL-2 突变体(IL-2-C125A/L18M/L19S)较野生型的IL-2具有更高的稳定性和活性


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