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《重庆大学》 2003年
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重组大肠杆菌不耐热肠毒素及其突变体以及其B亚单位的构建表达与性质研究

冯强  
【摘要】:大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin, LT)是一种能导致人畜腹泻的 毒性因子,为产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia, ETEC)产生的六聚体 蛋白。除了很强的毒性以外,LT 具有很强的免疫原性并且能够辅佐其他抗原通过 粘膜免疫途径使机体产生特异抗体,因而 LT,尤其是其无毒或低毒突变体,还是 良好的粘膜免疫佐剂,在粘膜免疫研究中以及粘膜免疫疫苗开发中具有重要医学 价值和经济价值。另外,由于 LT 是由一个具有毒性的 A 亚单位(LTA)和形成环 状的五个能够与神经节苷脂 GM1 结合而粘附于真核细胞膜上的 B 亚单位(LTB) 组成,结构与功能都很复杂,不同位点的氨基酸突变会对其高级结构和功能产生 各不相同的影响,因而研究 LT 的突变体,不但可以筛选出可以应用于临床的侯选 粘膜免疫佐剂,而且还可拓宽我们对蛋白质结构与功能的认识。 研究目的:获得适应中试规模生产、具较高表达效率的 LT 及 LT 的 B 亚单位 (LTB)表达系统。通过对 LT 的表达、纯化及保存的方法进行探索,寻找到 LT 优化的表达、纯化及保存方案。初步筛选出毒性较小、粘膜免疫佐剂活性较高的 LT 突变体,同时就氨基酸突变对 LT 结构与功能的影响作一些理论探讨。 研究方法:通过用改良的基因组提取方法从野生型产毒性大肠杆菌中提取到 lt 基因。利用基因工程技术将其重组于表达载体中并转化宿主菌,在摇瓶中筛选优 化的表达系统。改变 Immobilized D(+)-galactose 亲和柱平衡缓冲液及目的蛋白洗脱 液的成分及 pH 值,优化纯化方案。通过对不同保存条件下的 LT 用 HPLC 作分子 筛层析判断 LT 结构稳定性筛选出最佳保存方案。利用基因工程的定点突变技术, 构建 LT 突变体。用在分子筛层析洗脱液中加入 1%SDS,观察在洗脱过程中 A280nm 的区别判断 LT 与突变体之间结构稳定性的差异、从胰酶消化后 LTA 裂解出 LTA1 的多少判断 LT 及突变体对胰酶的敏感性、用在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞毒性检 测中导致 CHO 细胞变形的剂量和程度及在 Patent-mouse 活体毒性检测中导致肠内 液体的多寡判断 LT 及突变体的毒性。LT 突变体的粘膜免疫佐剂效应由下述方法 进行评价:将 LT 突变体作为幽门螺杆菌(Hp)尿素酶 B 亚单位(UreB)的佐剂, 口服免疫 BALB/c 小鼠,用 ELISA 法检测血清及粘膜部位抗原特异的抗体水平、 用 ELISPOT 法观察肠派伊尔结(PP 结)抗体分泌细胞、用 RT-PCR 法检测细胞 因子的差别表达并与其他佐剂及疫苗进行比较。 研究结果: 1、用改良基因组提取法从野生型产毒大肠杆菌中提取到含 lt 基因的质粒。 2、 在生长于改良 M9-CAA 培养基的含 pET11c-LT 重组质粒的 E.coli I WP=6 重庆大学博士学位论文 BL21(DE3)中以约 46mg/L 培养基的较高效率分泌表达出重组 LT。 3、 LT 在纯化后马上冻干并保存于 4℃可以长久保持其完整的六聚体结构。该 法可避免 LT 以液态形式在缓冲液中 4℃或-70℃保存一定时间后发生解聚现象。 4、 构建了 LTK63(第 63 位氨基酸由 S K),LTR72(第 72 位氨基酸由 A R) 和 LTKR(第 63、72 位氨基酸分别由 S、A 突变为 K、R)。 5、LTA2 结构域内的第 229、230、232、233 位的 4 个氨基酸由 E、V、I、Y 分别突变为与霍乱毒素该 4 个氨基酸相同的 D、I、T、H,命名为 LTDITH,同时 构建了 LTK63,LTR72 和 LTKR 的相应的 LTA2 结构域突变体 LTKDITH、LTRDITH 和 LTKRDITH。另外还将 LTDITH 的第 232 位氨基酸突变为 Lys,命名为 LTDIKH。 6、 对重组 LT 及其突变体进行了中试规模发酵并纯化后统计发现 A2 结构域 特定突变后的 LT,其表达效率大大提高,可达 160mg/L 培养基。 7、 用 HPLC 对野生 LT 及各种突变体进行结构稳定性检测后, A2 结构域特 定突变后的 LT 其稳定性大大增加。相对于 LT,LTK63 结构稳定性增加;LTR72 结构稳定性降低;LTKR 结构稳定性增加。 8、 LTA2 结构域特定突变后的 LT 的胰酶敏感性降低。LTK63、LTKR 比 rLT 及 LTR72 的胰酶敏感性降低。 9、 用 CHO 细胞毒性检测实验和 Patent-mouse 毒性检测实验表明,LTDITH 的毒性显著低于 rLT。 10、 pET22b(+)-LTB/E.coli BL21(DE3)表达系统使 LTB 在 pelB 信号肽的引导 下既可分泌表达至胞周质,也可使 LTB 以包含体形式存在。分泌表达的 LTB 能用 半乳糖亲和柱一步纯化出来,包含体形式存在的 LTB 能通过溶解、缓冲液置换后, 再用半乳糖亲和柱纯化,两种方法纯化的 LTB 具有相同的氨基酸组成并且具有正 常的免疫原性和 GM1 结合活性。 11、 LT 突变体及 LTB 在与 Hp 尿素酶 B 亚单位(UreB)通过口服途径免疫 小鼠后具有明显的佐剂效应,血清 IgG、粘膜部位的 sIgA、PP 结抗体分泌细胞及 细胞因子如 IL-4、IFN-γ 的表达都明显增加。 结论:改良的基因组提取方法是提取大质粒的简便方法。用 HPLC 结合分子 筛层析可以判断 LT 的结构稳定性。LTK63 对 LT 六聚体的结构还有明显的影响。 LTDITH 及基于 LTDITH 的突变体能显著改变 LT 的结构与功能,即增加
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R346

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