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骨胶原基质的制备、理化性能及其生物相容性研究

何创龙  
【摘要】:寻找合适的骨修复材料一直是骨科和生物材料领域面临的的一个艰巨挑战。 目前使用的修复材料都存在不同的缺陷,难以完全满足临床需要。骨组织工程学 为大范围骨缺损的修复开辟了新的渠道,细胞外基质材料的开发是其中的关键。 天然异种骨具有来源丰富、价格低廉等优点,是骨组织工程细胞外基质材料和骨 缺损移植材料的潜在来源之一。 本文主要研究一种新型骨胶原基质(bone collagen matrix,BCM)的制备方法, 采用优化的脱脂、部分脱钙、盐酸胍浸泡、胰蛋白酶消化等一系列生物和化学方 法对牛骨进行脱抗原处理,对所得材料的各项理化性能进行测试,并进行体外细 胞相容性和体内的组织相容性实验研究。主要研究内容和结论如下: (1) 屠宰场获得新鲜牛骨,经适当前处理后,采用如下的方法制备BCM: 加工好的骨块→50℃热水反复冲洗→室温稀碱液浸泡→脱脂剂脱脂→部分脱钙→ 脱非胶原蛋白→胰蛋白酶消化→50℃真空干燥→消毒→密封包装,备用。 通过上述方法最终制备出两种BCM材料,即松质骨胶原基质(Trabecular Bone Collagen Matrix,TBCM)和皮质骨胶原基质(Cortical Bone Collagen Matrix, CBCM),TBCM与PDLLA复合成TBCM-PDLLA复合材料。采用色氨酸含量作 为非胶原蛋白去除效果的评价指标,以羟脯氨酸的含量来衡量胶原的破坏程度, 并以XRD结果来定性分析部分脱钙对骨矿结构的影响。结果表明经HC1胍处理 24h后两种骨块中的色氨酸浓度接近2mg/g,胰蛋白酶消化后降低到1mg/g左右。 胰蛋白酶消化能够切除胶原蛋白具有免疫原性的端肽部分,其三螺旋结构得以保 留,脱蛋白后胶原溶出的比例低于1%。XRD结果表明经过盐酸部分脱钙,骨组 织的主要的晶相成分保持不变,骨矿的晶体结构也没有发生显著变化。 (2) 付立叶红外光谱(FTIR)、x-射线衍射光谱(XRD)、能量散射X-射 线荧光光谱(EDXRF)和差热扫描分析(DSC)对材料进行成分和物相分析;力 学测试仪测试材料的力学性能;扫描电镜(SEM)观察材料的微观结构;并测试 了材料中各种成分的含量和孔隙率。结果如下: ① 光谱学分析表明三种材料中的骨矿成分主要是碳酸盐羟基磷灰石,Ca/P摩 尔比为1. 95-2. 03。骨的有机成分主要是胶原,脂肪和细胞成分被完全脱除。 ② 力学性能测试表明CBCM的拉伸杨氏模量为5956±1259 Mpa,其压缩模量 达到12. 47±7. 64Gpa,TBCM和TBCM-PDLLA的压缩模量达到90-100 Mpa, 与原骨的力学性能相近。表明整个加工没有对材料的力学性能造成太大的影响, 重庆大学博士学位论文 PDLLA的加入有助于提高松质骨材料的力学强度。 ③扫描电镜观察表明,CBCM的孔径为10一40阿,TBcM和TBcM一PDLLA 的孔径为200~500脚,且孔壁光滑,孔隙连通较好。液体置换法测得TBCM和 TBCM一PDLLA的孔隙率为50%以上,而CBCM的孔隙率低于10%。 (3)将材料与大鼠成骨细胞在体外复合培养,形态学和组织学观察发现成骨 细胞能够在材料上粘附并保持其原有形态。MTT检测结果表明成骨细胞能够在材 料上正常伸展和增殖,证明材料无明显细胞毒性。碱性磷酸酶(ALP)和成骨细胞 分泌钙质的测定结果显示复合培养的成骨细胞能够正常分化和分泌细胞外基质, 反映材料具有较好的生物相容性,不损害细胞的生物功能;各项指标均显示松质 骨材料明显优于皮质骨材料,而TBCM一PDLLA材料略优于TBCM材料。 (4)设计兔双侧挠骨骨干缺损模型,将材料植入体内双侧挠骨和背部骸棘肌 下,通过大体观察、组织学观察、ELISA和局部细胞免疫测定等方法,研究了材 料在体内的毒性反应和免疫排斥反应。结果表明材料均无细胞毒性,但具有较低 的免疫原性,在兔体内引起免疫反应的大小为TBCMTBCM一PDLLACBCM, 由于免疫反应持续时间较短,未超出动物的耐受能力,不会对机体的生长造成大 的伤害。 (5)以兔双侧挠骨骨干缺损模型对各种材料的体内成骨性能进行研究,通过 X线片和组织学分析研究材料的成骨能力。结果显示三种材料的成骨能力大小依次 为:TBCM一PDLLA、TBCM)CBCM,统计学分析表明TBCM一PDLLA与TBCM 的成骨能力无显著性差异。在术后12周:TBCM一PDLLA与TBCM组骨缺损区 被新骨替代而修复;CBCM组有新生骨组织生成,骨缺损区部分被修复;空白对 照组缺损未被修复。各组材料主要以传导成骨方式实现骨的“爬行替代”,材料的表 面结构和多孔结构对成骨能力有重要影响。TBCM一PDLLA与TBCM具有天然多 孔的结构特点,能够为成骨细胞提供良好的微环境,有利于细胞粘附生长和营养 物质进入,适宜新骨的长入,可以作为骨移植材料和骨组织工程细胞外基质材料 使用。CBCM材料的力学强度使之有可能用于节段性骨缺损的修复,但其孔隙率 和降解速度大大影响了材料的成骨能力。


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1 李忠,杨柳,林炎水,陈光兴;胶原凝胶包埋软骨细胞接种骨胶原基质支架体外构建组织工程软骨[J];四川医学;2005年10期
2 李忠;杨柳;何创龙;陈光兴;林炎水;段小军;;胶原凝胶复合骨胶原基质(BCM)负载关节软骨细胞的实验研究[J];中国骨与关节损伤杂志;2005年10期
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