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《重庆大学》 2004年
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PSGL-1酪氨酸替换及细胞表面微拓扑结构和刚度对选择素-配体反应动力学的影响

肖波涛  
【摘要】:在炎症反应过程中,选择素-配体的相互作用介导了白细胞在血管内皮表面的滚动和结合。选择素-配体相互作用的化学反应速率、反应亲和性和力学强度对白细胞的滚动起决定性作用。影响着这些化学、物理性质的因素是他们的结构和所处的载体表面环境。其中,载体表面微拓扑结构不仅影响着选择素-配体,还左右着其他粘附分子,进而影响着细胞的粘附、组装乃至形成组织。 本文的内容之一是从氨基酸水平考察选择素配体的结构-功能关系。三种选择素(P-、E-、和L-选择素)都有一个共同的配体PSGL-1(P-selectin glycoprotein ligand-1)。PSGL-1与P-或L-选择素发生粘附需要同时含有两个必要结构:46、48和51位酪氨酸的硫酸化;57位苏氨酸的O型糖苷,并经过sLex(sialyl Lewis x)修饰。对以上3个位点的酪氨酸作替换构建多种变异体,这些变异体与选择素的相互作用有不同的逆反应速率和力学强度。 为进一步考察以上3个位点的酪氨酸在PSGL-1和选择素粘附中的作用,本文采用微管吸吮实验技术测量了PSGL-1变异体与选择素粘附的反应速率和反应亲和性。人源PSGL-1野生型、经46、48和51位酪氨酸两两替换的四种变异体(均作糖基化修饰)通过转染表达在中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)上。采用CrCl3方法把选择素捕获包被在红细胞上。微管实验测量了粘附频率对接触时间的依赖关系。应用小系统化学反应动力学随机理论对实验数据进行拟合,得到了反应速率和反应亲和性参数。结果表明酪氨酸的替换对逆反应速率影响不大。有趣的是,PSGL-1野生型的反应亲和性是上述变异体的7.8~16倍。这同时说明变异体的正反应速率因酪氨酸替换而大大降低。实验结果在氨基酸水平扩展了对选择素-配体的相互作用的认识。 选择素-配体以及其他粘附分子都表达在载体表面。为考察载体表面粗糙度和表面刚度对二维反应的影响,本文第二部分建立了相应的方法学。采用玫瑰花瓣实验模拟不同载体间的二维反应,得到相互结合的载体。对于这些载体,扫描电镜技术观察到了表面粗糙度和表面刚度的差异。为深入比较这些差异,本文发展了改进的生物膜力探针技术。简化了生物膜力探针的蛋白包被方法,采用了多种工作模式。应用小系统化学反应动力学随机理论对实验结果进行分 WP=5 析,使之能同时测量逆反应速率、反应亲和性和1~1000 pN的粘附力。特异性实验结果理想。这些拓展了生物膜力探针的应用范围。本文建立的方法学对于认识细胞粘附具有一定的意义。
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R341

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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1 黄俊;选择素—配体相互作用动力学[D];重庆大学;2003年
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