昆虫病原真菌金龟子绿僵菌中性海藻糖酶在孢子储藏稳定性中的作用

【摘要】：蝗虫是世界性的害虫,给农业生产带来了严重的经济损失。金龟子绿僵菌是一种蝗虫病原真菌,在蝗虫生物防治中起着重要作用。目前,世界上已经有十多个金龟子绿僵菌菌株登记注册,并实现了商品化,但这些产品常常不稳定。阻碍绿僵菌杀虫剂大规模应用的主要原因之一是孢子的储藏和环境稳定性问题。本实验室从我国蝗虫病原菌中分离、选育出一株高毒力、高产孢、强专化性的杀蝗新菌株金龟子绿僵菌CQMa102,用该绿僵菌生产的孢子粉及其油悬浮剂已在国内登记注册,正逐步实现商品化,却也同样存在进一步延长储藏期,增强环境稳定性的问题。 大量研究报道,海藻糖是广泛存在于各种生物体内的抗逆境剂,具有增强生物体对高温、脱水、干旱、冷冻、高渗透性、重金属及有毒试剂等逆境的抵抗能力。胞内海藻糖积累与丝状真菌孢子的储藏期延长密切相关。将酿酒酵母细胞内中性海藻糖酶基因敲除后,中性海藻糖酶活性丧失,海藻糖含量提高3 倍。由此我们可以推测,通过基因工程技术改变绿僵菌体内海藻糖代谢途径,可以提高孢子内海藻糖含量,延长绿僵菌孢子的储藏期,增强其环境稳定性,促进其商品化生产和应用。 要通过改变海藻糖代谢途径来改良绿僵菌菌种,就必须了解绿僵菌体内海藻糖的代谢和调控,但是人们对绿僵菌体内海藻糖的代谢研究得较少,夏玉先等首先克隆了金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因,但其生物学功能还未见报道。本研究拟通过增加金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的拷贝数以减少孢子形成过程中海藻糖的合成,采用基因破坏技术去除或降低金龟子绿僵菌中性海藻糖酶活性以增加孢子中海藻糖含量,并进一步分析孢子中海藻糖的含量及其与孢子抗逆能力和耐储藏能力的关系,从而阐明中性海藻糖酶在孢子耐热力和储藏稳定性中的作用。 本研究利用PCR、RT-PCR、RACE、panhandle PCR 等方法成功地克隆了金龟子绿僵菌CQMa102 中性海藻糖酶基因,并登录NCBI 的GenBank, 登录号为:AY557613(基因组序列), AY557612(cDNA 序列)。根据该基因序列构建了金龟子绿僵菌中性海藻糖酶超表达载体、同源置换载体和RNA 干扰载体,分别利用PEG-CaCl_2 介导法、电转化法和基因枪法,转化金龟子绿僵菌CQMa102,经过PCR 筛选和Southern blot 验证,获得3 个中性海藻糖酶超表达转化菌和3 个RNAi 转化菌。利用Northern blot 分析这几个突变菌株中性海藻糖酶基因mRNA 的含量,选择中性海藻糖酶基因超表达2 倍和中性海藻糖酶基因被抑制到42%的两个转化菌:Ma113 和Ma688,将其与出发菌株进行分生孢子内海藻糖含量的测定,孢子储藏