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《重庆大学》 2005年
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实时定量PCR技术检测东亚飞蝗体内绿僵菌的方法研究

张清平  
【摘要】:昆虫病原真菌在生物防治中有重要作用。金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)能侵染多种鳞翅目昆虫,广泛用于生物防治,是最常用的生物农药之一。但是真菌农药存在菌株选育困难、菌株毒力下降、生产工艺研制滞后、缺乏质量控制体系等问题,这严重制约着杀虫真菌农药产业的形成与发展,其主要原因之一是缺乏快速准确的毒力评价方法。昆虫病原真菌的致病机制十分复杂,但是病原真菌菌体在寄主体内快速增殖是寄主昆虫罹病死亡的前提,其增殖数量及速率直接影响致病过程及杀虫效率。建立昆虫体内病原真菌的早期定量检测方法,迅速定量检测蝗虫体内病原真菌的数量,确定病原真菌的侵染速度和在蝗虫体内变化趋势,能满足菌株选育、制剂研制以及制剂质量评价与监控中对杀虫剂毒力评价的需要,为我国生物农药的生产、研发和检测提供技术支持。 本文研究包括:a)从东亚飞蝗血淋巴中获取适合PCR 扩增的绿僵菌DNA;b)建立东亚飞蝗体内绿僵菌的荧光定量PCR 检测体系。 主要研究结果如下: 1.利用数码生物显微镜观察了CQMa102 分生孢子萌发侵染东亚飞蝗的过程。在接种绿僵菌60h 以内的蝗虫血淋巴中未发现虫菌体。在接种72h 时,东亚飞蝗血淋巴中开始出现绿僵菌虫菌体,从接种72h 到96h,蝗虫血淋巴中的绿僵菌虫菌体逐渐增多,蝗虫临死前,血液中充满绿僵菌,几乎找不到蝗虫血细胞。 2. 设计了特异性较好的引物。根据绿僵菌核糖体DNA(ribosome DNA, rDNA)的转录间隔区(Internal Transcribed Spacers,ITS)和5.8S 的基因序列,设计能准确区分东亚飞蝗和绿僵菌基因组DNA 的特异引物,该引物适于用SYBR Green I为荧光来源的定量PCR 方法检测东亚飞蝗体内的绿僵菌。 3. 建立了定量检测的标准曲线。用多种试剂进行荧光定量PCR 扩增,根据标准曲线的拟合度和PCR 的扩增效率选出最佳试剂为:Bio-rad 公司的iQTM SYBR Green supermix。以10 倍稀释的绿僵菌DNA 为模板,用该试剂进行PCR 扩增,绘制标准曲线,定量范围达到6 个数量级(1×10-7μg 至10-2μg 的绿僵菌DNA),定量的检测底线是10-7μg/25μl 体系。 4.优化了从感病蝗虫血淋巴中快速制备绿僵菌DNA 方法。使用巯基化合物预处理、双酶解破壁,能在较短时间(2h)里使绿僵菌细胞壁完全破裂;微滤柱过柱,能去除PCR 抑制物质,得到适合于定量PCR 检测的DNA 模板,并对该方法的稳定性进行了测试,5 次重复的变异系数仅为0.015,说明该方法稳定性较好。 5.供试蝗虫体重对PCR 测试结果的影响。研究发现:在0.6-0.8g 体重范围内,
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S476.1

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