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半夏的组织培养和人工种子研究及其指纹图谱初探

殷红莲  
【摘要】:为了有效解决半夏种苗快速繁殖和对不同产地来源的半夏进行有效鉴别,本实验以传统中药材—天南星科植物半夏Pinellia ternate(Thunb.)Breit为材料,对半夏的组织培养技术、人工种子的制作流程及人工胚乳、播种条件、贮藏条件等进行了研究,同时对不同产地半夏的指纹图谱的建立进行了研究。主要结果如下: 1.通过半夏叶的不同部位诱导愈伤组织获得半夏无菌试管苗,建立起了半夏组织培养快速繁殖体系。结果表明:半夏叶柄基部在MS+2,4-D 0.2 mg/L+KT 1.0mg/L的培养基上诱导出的愈伤组织效果最好;愈伤组织在MS+2,4-D 0.5 mg/L+KT 1.0 mg/L+ABA 0.5 mg/L+AC 0.4 g/L培养基上继代培养可提高愈伤组织的增殖率,并降低褐变率。 2.通过在愈伤组织的诱导和分化过程中分别加入不同浓度的多效唑和B9的实验结果表明,多效唑是半夏壮苗培养有效的外源调节物质。通过对不同多效唑浓度下培养苗生物学性状的比较,结果显示,低浓度的多效唑有利于组培苗的矮化和壮苗,高浓度的多效唑抑制半夏组织培苗的正常生长。其最佳矮化和壮苗培养基为MS+2,4-D 0.5 mg/L+KT 1.0 mg/L+多效唑0.6 mg/L。在所选B9的浓度中对半夏愈伤组织的诱导和分化影响不大,各个浓度B9的分化率与对照基本都无显著差异。 3.进行了半夏人工种子制作流程、人工种皮、人工胚乳、播种条件、贮藏条件等方面的研究。结果表明:从半夏愈伤组织表面切取2-3mm小块茎,包埋在3%海藻酸钠里,滴入2%CaCl_2中反应15-20 min,用1/2MS培养液配制人工胚乳,直接播种在铺有浸润滤纸的培养皿中萌发,萌发率可达76%。在人工胚乳中添加多菌灵,有助于提高半夏人工种子在有菌条件下的萌发率。4℃下贮存的人工种子30d内发芽率可达45.7%。 4.通过收集不同产地的半夏药材样品及其常见替用品和伪品,建立了半夏药材的高效液相色谱指纹图谱的研究方法。确定了指纹图谱的测定条件,色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,4.6×250 mm);流动相:A95%甲醇,B纯水;线性梯度洗脱:0.01-5min 100%B,5-10 min 100%-98%B,10-30 min 98%-90%B,30-70 min 90%-0%B;流速:1.0 mg/L;检测波长:254 nm;柱温:30℃;进样量:20μl。通过分析指纹图谱,确定了21个峰为半夏药材指纹图谱的共有峰,构成该药材特有的色谱指纹图谱特征,以10号峰为参照物,对其他色谱峰的相对保留时间和相对峰面积进行计算,作为技术参数评价指纹图谱。并确定其中9个峰作为鉴别半夏药材与半夏替用品和伪品的群体特征峰,其α值


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