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《重庆大学》 2006年
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一种新的金龟子绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的纯化、特性及基因克隆

李振轮  
【摘要】: 本文以金龟子绿僵菌蝗变种(Metarhizium anisopliae var. acridum )CQMa102菌株为研究材料,用酪蛋白从液体培养基中诱导出一条pI为9.45的磷酸酶,纯化后酶特性研究表明是一种嗜热酶。该酶的氨基酸序列分析表明其与真菌碱性磷酸酶同源,但其底物特异性、酶抑制剂的专一敏感性和含有酪氨酸蛋白磷酸酶的标志序列证明这是一个新的酪氨酸蛋白磷酸酶。而且,该酶在体外能改变其寄主(蝗虫)血淋巴中与信号传导相关的蛋白(Toll-like receptor)的磷酸化状态,进而可能干涉寄主体内免疫活动,这为设计和改造新的真菌杀虫剂提供一种新的技术途径,具有重要的理论与应用价值。 全文的主要结论如下: 一、发酵条件研究 采用单因子实验分析培养条件对绿僵菌生长及产酸性磷酸酶的影响,结果表明,有机氮、葡萄糖和蛋白有机磷有利于绿僵菌生长和产酸性磷酸酶。酸性磷酸酶同工酶分析表明,酪蛋白作为磷源培养绿僵菌时,有一条比较特别的磷酸酶带出现,其pI为9.45,明显不同于其他磷源。因此,我们选择了这条磷酸酶带为我们纯化的目标。根据实验结果确定了纯化目标蛋白的培养条件为:葡萄糖,20g/L;(NH4)2SO4,2g/L;酪蛋白,4g/L;KCl,0.5g/L;MgSO4,0.5g/L;微量元素混合液,10ml/L;接种量,1×107孢子/100ml培养基;装液量,100ml;10g/LMES,pH 6.0;在27°C条件下振荡(160rpm)培养78h。 二、蛋白纯化及特性研究 培养液经过ConA-Sepharose亲和层析、HighQ阴离子交换层析和25S阳离子交换层析后,得到均一性好,纯度高的目标蛋白,回收率达41%。电泳法测定蛋白的pI为9.45,分子量为82.5kDa,用TMSF去糖基后表观分子量为69kDa,因此该蛋白含碳水化合物16.4%。酶底物特异性研究表明该磷酸酶对磷酸酪氨酸残基底物专一性强,而且丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂(EDTA、NaF和冈田酸)、酸性磷酸酶抑制剂(EDTA、酒石酸钠)和碱性磷酸酶抑制剂(EDTA)对酶酶解pNPP和O-phospho-L-tyrosine活性没有明显的抑制作用;但酪氨酸蛋白磷酸酶抑制剂(钼酸钠、原钒酸钠、N-乙基马来酰亚胺和钨酸钠)显著抑制酶对O-phospho-L-tyrosine的酶解活性,因此该磷酸酶应该是酪氨酸蛋白磷酸酶。该酶的最适作用温度大约是75°C,最适pH是5.5,热稳定性及pH稳定性好。除Ni2+外,Ca2+、Co2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+和Ba2+在5mM以上都明显抑制酶降解pNPP的活性。Zn2+、Fe2+、Cu2+和Ag+显著抑制酶水解O-phospho-L-tryosine的活
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