番茄MBF1转录辅激活因子基因的克隆载体的构建及转化番茄
【摘要】：
逆境胁迫因子主要有干旱、盐渍、低温、水涝等,是限制植物生长和区域分布以及影响农作物产量和质量的重要因素。植物对这些逆境胁迫的适应主要被转录因子和调节基因(诸如控制多重抵御的酶、蛋白等)所介导。现有研究证明,与转录因子活力有关联的是转录辅激活子,它能增强转录因子和顺式作用元件的结合。MBF1是一个转录辅激活子,通过一个激活物和一个TATA盒结合蛋白的桥连作用来调节转录激活。MBF1基因最早是在蚕、果蝇等动物体中被发现,后来在植物中也发现了MBF1基因。据报道,在拟南芥中的MBF1基因的超表达能增强其抵抗逆境胁迫的能力,而在番茄中关于此基因还没有相关的报道,本论文拟通过在番茄中超表达MBF1基因研究其对逆境胁迫的抗性能力,从而明确MBF1基因的分子作用机制,主要研究内容及结果如下:
1.番茄MBF1基因的克隆
以AC++番茄果实的总RNA为模板,体外反转录合成cDNA,以cDNA为模板,通过PCR扩增得到得632bp大小的片段,将其命名为LeMBF1,并登录NCBI GenBank,登录号为EF051474。将其与拟南芥中的MBF1基因进行同源性比较,在DNA水平上的序列相似性为56%,在氨基酸水平上的序列相似性为82%,是一个新基因。
2. Northern杂交技术分析番茄LeMBF1基因的表达特性
克隆番茄MBF1(LeMBF1)基因特异片段,以此作为探针,通过Northern杂交技术分析LeMBF1基因的表达特性,结果显示LeMBF1基因的表达能被高温、干旱诱导,被复水所抑制;伤害处理能诱导WT番茄叶片中该基因的表达,对Nr番茄叶片中该基因的表达基本无影响,抑制rin番茄叶片中该基因的表达;外源乙烯处理绿熟期果实,LeMBF1基因的表达变化不明显,说明在这一时期外源乙烯并不诱导LeMBF1基因的表达。
3.双元超表达载体pBIN19-MBF1的构建
验证的LeMBF1基因与经Pst I酶切的pDH51载体通过T4 DNA连接酶连接,连接产物转经PCR以及酶切鉴定确为重组中间载体质粒,且外源片段方向正确,命名为pDH51-MBF1。中间载体pDH51-MBF1经EcoR I酶切获得了包含35S启动子、MBF1基因、35S终止子的片段,此片段与经EcoR I酶切的pBIN19载体连接,连接产物经PCR及酶切鉴定确为重组植物双元表达载体质粒,命名为pBIN19-MBF1。
4.再生番茄植株的获得
以AC++番茄子叶为外植体,通过农杆菌LBA4404介导,将CaMV 35S启动子调控下的MBF1基因转入番茄,经过50 mg/L Kan及500 mg/L的Sm筛选,获得一部分生根的再生植株。
【关键词】：逆境胁迫 转录辅激活子 番茄 LeMBF1 【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S641.2;Q943.2
【DOI】：CNKI:CDMD:2.2007.180813
【目录】：
- 中文摘要3-5
- 英文摘要5-12
- 1 绪论12-22
- 1.1 引言12
- 1.2 植物逆境反应的生理基础12-13
- 1.2.1 植物的抗逆性12-13
- 1.2.2 植物在一般逆境下的生理变化13
- 1.3 植物逆境应答的分子机制13-15
- 1.3.1 植物对逆境的应答13-14
- 1.3.2 植物逆境的信号转导与调控因子14
- 1.3.3 顺式调控原件14-15
- 1.3.4 转录因子（反式作用因子）15
- 1.4 核受体转录辅激活因子15-19
- 1.4.1 核受体15-16
- 1.4.2 转录辅激活因子的结构16
- 1.4.3 转录辅激活因子的作用机制16-18
- 1.4.4 核受体辅调节因子促进基因表达18
- 1.4.5 MBF1（Multiprotein Bridging Factor 1）基因的研究进展18-19
- 1.5 研究的目的及意义19-20
- 1.6 研究的主要内容20
- 1.7 技术路线20-21
- 1.7.1 番茄LeMBF1 基因的克隆及表达模式的研究20
- 1.7.2 LeMBF1 超表达载体的构建20-21
- 1.7.3 番茄的转化21
- 1.8 本论文的创新点21-22
- 2 番茄 MBF1 基因的克隆22-37
- 2.1 材料与试剂22-24
- 2.1.1 植物材料、质粒、菌株、试剂22
- 2.1.2 主要仪器设备22
- 2.1.3 常用试剂配制22-24
- 2.2 实验方法24-29
- 2.2.1 番茄总RNA 的提取24
- 2.2.2 核酸质量及浓度测定24
- 2.2.3 克隆番茄LeMBF1 基因全长24-29
- 2.3 结果与分析29-35
- 2.3.1 普通番茄总RNA 的提取29-30
- 2.3.2 MBF1 基因的克隆30-35
- 2.4 讨论35-37
- 3 番茄 LeMBF1 基因的表达模式研究37-44
- 3.1 材料与试剂37-38
- 3.1.1 植物材料37
- 3.1.2 主要仪器设备37
- 3.1.3 主要化学试剂和试剂盒37
- 3.1.4 试剂的配置37-38
- 3.2 实验方法38-40
- 3.2.1 番茄果实的采集38
- 3.2.2 环境胁迫和乙烯处理番茄植株38-39
- 3.2.3 总RNA 的制备39
- 3.2.4 Northern 杂交39-40
- 3.3 结果与分析40-42
- 3.3.1 不同温度对番茄LeMBF1 基因表达的影响40-41
- 3.3.2 干旱、复水对番茄LeMBF1 基因表达的影响41
- 3.3.3 伤害对WT、Nr 和rin 番茄叶中MBF1 基因表达的影响41-42
- 3.3.4 乙烯对番茄MBF1 基因表达的影响42
- 3.4 讨论42-44
- 4 番茄 LeMBF1 超表达载体的构建、转化与鉴定44-59
- 4.1 材料与试剂44-46
- 4.1.1 植物材料、质粒、菌株44
- 4.1.2 主要仪器设备44
- 4.1.3 主要化学试剂和试剂盒44
- 4.1.4 实验所用试剂的配制44-46
- 4.2 实验方法46-51
- 4.2.1 质粒DNA 的制备46-47
- 4.2.2 MBF1 基因重组到过渡载体pDH5147-48
- 4.2.3 植物表达载体的构建48-49
- 4.2.4 番茄的遗传转化49-50
- 4.2.5 农杆菌介导的番茄转化50-51
- 4.3 结果与分析51-58
- 4.3.1 MBF1 基因构建到过渡载体 pDH51 上的 PCR 鉴定以及酶切鉴定53-54
- 4.3.2 植物表达载体的构建与鉴定54-55
- 4.3.3 番茄的遗传转化55-58
- 4.4 讨论58-59
- 5 结论与展望59-60
- 5.1 主要结论59
- 5.2 后续研究工作的展望59-60
- 致谢60-61
- 参考文献61-65
- 附录65
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