收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶的功能研究

刘迎春  
【摘要】: 金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在昆虫防治中起着重要作用。与化学农药相比,真菌杀虫剂尽管安全,无环境污染,但存在着杀虫速率缓慢的弱点,这在很大程度上阻碍了真菌杀虫剂的应用。对昆虫病原真菌致病机制进行研究可为发展新型高效真菌杀虫剂提供依据。海藻糖是一种非还原性二糖,存在于所有已知种类的昆虫中,是昆虫血淋巴中主要的糖类(大约占80-90%)。海藻糖在昆虫血液生理中起着重要的作用,其耗竭可能对昆虫起着致命性的作用。虫生真菌侵染进入昆虫血腔后,昆虫血淋巴中的海藻糖成为真菌生长主要的营养物质。但海藻糖对许多真菌来说是非渗透性二糖,必须在相应的二糖水解酶作用下分解为葡萄糖才能被真菌利用。金龟子绿僵菌侵染进入昆虫血淋巴后,能分泌酸性海藻糖酶,有效地降解昆虫血淋巴中的海藻糖。因此酸性海藻糖酶在真菌对昆虫的致病过程中起着重要的作用。 目前对真菌酸性海藻糖酶的研究较少,只有少数几个物种的酸性海藻糖酶基因被克隆并测定序列。在虫生真菌中,除了本实验室报道已纯化出金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶和获得该基因序列,还未见其他酸性海藻糖酶方面的报道。但是绿僵菌天然酸性海藻糖酶表达量少、不稳定、纯化步骤繁琐、成本高,不利于进一步研究酸性海藻糖酶。本研究以金龟子绿僵菌(M. anisopliae)菌株CQMa102为研究材料,结合RACE等技术手段,成功分离出绿僵菌酸性海藻糖酶基因全序列并登录NCBI的GenBank,登录号为:EF190950 (cDNA序列)。同时在毕赤酵母中成功表达绿僵菌酸性海藻糖酶,并与绿僵菌天然的酸性海藻糖酶进行酶学特性比较。此外,根据该基因序列构建了绿僵菌酸性海藻糖酶RNA干扰载体,获得3个RNAi转化子。研究结果为进一步利用基因工程手段改造病原真菌、提高生物防治效果奠定了基础。主要研究结果如下: 1.利用已知片段,结合RACE等技术手段分离出绿僵菌酸性海藻糖酶基因,其GenBank登录号为EF190950(cDNA序列)。酸性海藻糖酶(ATM1)DNA序列含有3个内含子,其开放阅读框(ORF)编码一个含1073个氨基酸的蛋白质,该酸性海藻糖酶具有一个20个氨基酸的信号肽序列和含有30个可能的N-糖基化位点( Asn-Xaa-Ser/ Thr )。NCBI序列比对(Blastn)显示该蛋白与Aspergillus fumigatus的alpha,alpha- trehalose glucohydrolase,Aspergillus nidulans的酸性海藻糖酶前体和Talaromyces emrsonii的酸性海藻糖酶分别有62%、59%和57%的氨基酸相似性;同时与另外两个真菌Saccharomyces cerevisiae (Ath1p)和Candida albicans (Atc1p)的酸性海藻糖酶也具有约25%的氨基酸相似性。 2.构建重组表达毕赤酵母菌株KM71/ATM1,并筛选出高效表达CQMa102酸性海藻糖酶的毕赤酵母菌株KM71/ATM1(pPATM1-21)。在0.5%甲醇诱导48个小时后,pPATM1-21菌株分泌酸性海藻糖酶达到最高峰5.35 units/mg protein (352 units/liter)。利用PCR技术,在构建表达载体pPIC9K-ATM1时,在ATM1序列的C-端引入组氨酸标签,一步Ni亲和层析纯化出酸性海藻糖酶(reATM1p)。 3.ReATM1p酶学特性分析:该蛋白为糖蛋白,等电点4.9,分子量170KDa;Trehazolin是其特异性抑制剂,其IC50为1.9×10-8M;海藻糖为该蛋白专一性底物,其最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.0;该酸性海藻糖酶特征米式常数(Km)为2.6mM,最大酶促反应速度(Vmax)为0.305 mmol min-1 mg -1 protein。 4.根据ATM1基因序列构建了金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶的RNA干扰载体,利用基因枪法,转化金龟子绿僵菌CQMa102,经过PCR筛选和Southern blot验证,获得3个RNAi转化子。3个RNA干扰菌株(RA14,RA42和RA74)ATM1的mRNA转录水平比野生型的分别下降了98.84%, 98.57%和96.56%。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 方卫国,张永军,肖月华,马金成,杨星勇,裴炎;金龟子绿僵菌羧基转运蛋白基因MaJEN1及其启动子的克隆与分析[J];遗传学报;2003年03期
2 史济平,叶丽,沈国祥,陈良康;金龟子绿僵菌对甾族化合物的11α-羟化[J];上海医科大学学报;1997年04期
3 李锡杰;周灵芝;张伟;郭卫华;杨鸣琦;赵元;;金龟子绿僵菌中苦马豆素的分离与鉴定[J];西北农业学报;2010年02期
4 李锡杰;杨鸣琦;张伟;郭卫华;戴卉敏;;金龟子绿僵菌中苦马豆素的提取[J];精细化工;2009年06期
5 应月青;张礼生;农向群;高松;张泽华;;微波对固体培养基灭菌效果的观察[J];中国消毒学杂志;2007年01期
6 钟伟,殷幼平;美洲大蠊血细胞对金龟子绿僵菌CQMa102菌株的免疫反应[J];重庆大学学报(自然科学版);2003年06期
7 孔平;李倩;李永娟;唐啸华;杨鸣琦;;金龟子绿僵菌代谢产物成分预试验及其生物碱的获得[J];湖北农业科学;2008年02期
8 刘迎春;夏玉先;;金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因的序列特性分析[J];福建医科大学学报;2008年06期
9 郭素萍,葛孝炎,叶刚;一种新的肽类抗生素——Myroridin[J];山西临床医药;1998年06期
10 王晓庆;张泽华;王广君;农向群;苏宇;;微波场对微生物DNA的作用研究[J];中国消毒学杂志;2009年01期
11 王荣新;雷大卫;苏晓庆;;贵阳腐霉Pr1蛋白酶的诱导条件研究[J];贵阳医学院学报;2008年01期
12 何亚琼;胡丰林;王利;樊美珍;;虫草及其无性型中的抗肿瘤细胞活性成分[J];生物学杂志;2008年01期
13 段斯亮;于声;苏晓庆;唐荣兰;申海光;马新博;;贵阳腐霉类胰蛋白酶纯化的初步研究[J];右江民族医学院学报;2011年05期
14 张向辉;彭心赋;左伟东;孙叙;;我国白蚁生物防治研究进展[J];中华卫生杀虫药械;2008年04期
15 方卫国,张永军,杨星勇,王中康,裴炎;球孢白僵菌降解昆虫体壁蛋白酶基因CDEP-1的克隆与序列分析[J];遗传学报;2002年03期
16 张国庆;;昆虫病原真菌对非洲传疟媒介成蚊的防制作用[J];国外医学.寄生虫病分册;2005年06期
17 姜志宽;王以燕;;我国的卫生杀虫剂发展概况[J];中华卫生杀虫药械;2006年06期
18 薛瑞德;公共卫生蝇类的生物防治原理与方法[J];中国公共卫生;1987年06期
19 管俊娇;虞泓;解云峰;左世梅;马荣锋;曾文波;;虫草属EST-SSR标记系统的建立研究[J];中国中药杂志;2011年13期
20 郭素萍,徐一强,张鸿翔;L8500菌发酵代谢物的提取及药理研究[J];中医药研究;1998年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 高强;商艳芳;黄威;王成树;;金龟子绿僵菌甘油吸收和甘油三酯合成途径对寄主致病能力的影响[A];中国菌物学会第五届会员代表大会暨2011年学术年会论文摘要集[C];2011年
2 李向英;李文华;彭国雄;王中康;夏玉先;;两株侵染东亚飞蝗的金龟子绿僵菌菌株的生物学特性比较[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第五卷)[C];2003年
3 李向英;彭国雄;王中康;曾德玉;殷幼平;夏玉先;;金龟子绿僵菌在不同制剂中的耐热性测定[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第五卷)[C];2003年
4 蔡守平;何学友;曾丽琼;黄金水;钟景辉;林传凤;;感染星天牛幼虫高毒力金龟子绿僵菌菌株筛选[A];海峡两岸第十届菌物学暨第三届食药用菌学术研讨会论文摘要集[C];2011年
5 方卫国;张永军;肖月华;杨星勇;罗明;范艳华;裴炎;;金龟子绿僵菌羧基转运蛋白基因JEN1的克隆与分析[A];首届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2002年
6 郭素萍;徐一强;祁学忠;赵俊生;;绿僵菌研究的新进展[A];走向21世纪的中国昆虫学——中国昆虫学会2000年学术年会论文集[C];2000年
7 任文彬;张世清;黄俊生;;金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae HN1)几丁质酶基因的克隆及高效表达[A];第十届全国杀虫微生物学术研讨会暨全国生物农药与化学生物学研究与产业化会议论文摘要集[C];2006年
8 谢宁;殷幼平;张建伟;申剑飞;王中康;;金龟子绿僵菌CQMa128的鉴定及其对鳞翅昆虫的毒力测评[A];中国菌物学会2009学术年会论文摘要集[C];2009年
9 李锡杰;杨鸣琦;张伟;郭伟华;戴卉敏;;金龟子绿僵菌菌丝体及发酵液中苦马豆素的提取与分离[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会论文集[C];2009年
10 陈斌;李正跃;桂富荣;孙跃先;严乃胜;;金龟子绿僵菌对马铃薯田小云斑鳃金龟子的生物防治潜力评价[A];加速发展云南马铃薯优势产业研讨会论文集[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张蕾;转基因金龟子绿僵菌获得的口服毒力评价与自噬基因ATG5对球孢白僵菌生防潜能的贡献[D];浙江大学;2013年
2 胡宗利;昆虫病原真菌金龟子绿僵菌中性海藻糖酶在孢子储藏稳定性中的作用[D];重庆大学;2005年
3 齐永霞;白僵菌和绿僵菌在植物根际的定殖及对几种土传植物病原真菌的抑制作用研究[D];安徽农业大学;2011年
4 赵华;昆虫病原真菌金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶分离纯化、特性及其基因克隆的研究[D];重庆大学;2006年
5 童应华;感染萧氏松茎象绿僵菌菌株筛选及其致病机理研究[D];福建农林大学;2009年
6 金少锋;基于金龟子绿僵菌和低剂量扑虱灵协同作用的稻飞虱防治替代策略研究[D];浙江大学;2010年
7 刘迎春;昆虫病原真菌金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶的功能研究[D];重庆大学;2007年
8 刘迎春;金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶的功能研究[D];重庆大学;2007年
9 詹儒林;芒果炭疽病菌抗药性基因tub2的克隆及其转化金龟子绿僵菌的初步研究[D];华南热带农业大学;2007年
10 张传博;金龟子绿僵菌侵染东亚飞蝗特异表达基因筛选与体内定殖阶段cDNA文库构建[D];重庆大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 叶小真;金龟子绿僵菌与化学农药相容性的初步研究[D];福建农林大学;2009年
2 李兴佳;金龟子绿僵菌在花生根系环境中的种群适应性及防治效果[D];中国农业科学院;2013年
3 臧欢;桃小食心虫优良金龟子绿僵菌菌株的筛选及应用性研究[D];河北农业大学;2013年
4 陈青林;球孢白僵菌和金龟子绿僵菌及其代谢产物的抑菌活性研究[D];安徽农业大学;2013年
5 刘颖;金龟子绿僵菌CQMa102致病相关基因CuAO的功能分析[D];重庆大学;2010年
6 钟伟;美洲大蠊对金龟子绿僵菌CQMa102菌株的免疫反应[D];西南农业大学;2003年
7 应月青;绿僵菌固体培养基的微波灭菌研究[D];中国农业科学院;2006年
8 金玉荣;青海血蜱高致病性绿僵菌菌株的筛选及生物学特性[D];甘肃农业大学;2009年
9 李春梅;从寄主昆虫血淋巴中获取病原真菌菌体的方法研究[D];重庆大学;2005年
10 路宏朝;金龟子绿僵菌代谢产物中有效成分的初步研究[D];西北农林科技大学;2006年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978