收藏本站
《重庆大学》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

绿僵菌和蝗虫中具有降解昆虫体壁功能蛋白酶基因的分离、克隆及功能研究

张伟  
【摘要】: 农业害虫是造成农作物减产的主要原因,同时也给林业和牧业造成了巨大的灾害。飞蝗是一种洲际性农业重大害虫,在我国,以东亚飞蝗[Locusta migratoria manilensis (Meyen)]分布面积广,危害最为严重。因而加强对飞蝗等农业害虫的研究和灾害的综合防治,已成为关系我国经济发展和社会稳定的重要因素。 长期以来,化学农药在害虫的防治中起着主导作用,这将直接导致三大环境问题:(1)污染环境,残毒积累,最终危害人类健康;(2)害虫抗药性直线上升,使化学农药用量不断增加,导致恶性循环;(3)杀伤天敌,破坏生态平衡,从而致使害虫再猖獗和次要害虫上升为主要害虫。为了降低环境污染,减少或禁用化学农药势在必行,开发高效、稳定的生物农药已成为当务之急。微生物杀虫剂具有无公害、无残留、害虫不易产生抗性等优点,日益受到人们的广泛关注。而杀虫真菌是昆虫病原微生物(细菌、真菌和病毒)中最大的一个类群,具有直接穿透寄主体壁和持续控制等优点,是其它微生物杀虫剂不可比拟的。绿僵菌是一种非常有效防治蝗虫的杀虫真菌,但是同其它杀虫真菌一样,存在着致死时间长等不足,影响其广泛应用。昆虫的体壁是抵御真菌侵染的第一道物理屏障,因而杀虫真菌穿透寄主体壁的成功率和速度是影响其杀虫时间的重要因素之一。杀虫真菌依靠酶解作用和机械压力穿透寄主体壁,在侵染过程中产生一系列的酶来降解昆虫表皮,其中蛋白酶起着主要作用。因而,来源于昆虫病原真菌的这类蛋白酶基因,已成为利用基因工程手段,构建高效杀虫真菌的重要毒力因子。 同时,除了昆虫病原真菌能产生降解昆虫体壁的蛋白酶外,昆虫自身也能产生降解自身表皮的蛋白酶。在昆虫蜕皮过程中,昆虫会分泌大量蜕液,其中包含以蛋白酶为主的一系列水解酶,来降解老表皮,并回收利用促进新表皮的合成。因此,本研究以昆虫病原真菌绿僵菌和东亚飞蝗为材料,分离、克隆具有壳降解功能的蛋白酶基因,并进行相关的功能验证、分析。为发展高效、安全的基因工程杀虫真菌提供毒力基因和前期的基础研究工作,这对于发展真菌杀虫剂及提高我国真菌农药产业的核心竞争力都具有重要的意义。同时,昆虫蜕液中的壳降解蛋白酶,与昆虫的蜕皮具有重要的关系,这类蛋白酶的缺损,将导致昆虫不能蜕皮,并最终导致死亡,是潜在的杀虫靶标。因此,研究昆虫壳降解蛋白酶基因及功能,对于研究昆虫的蜕皮生理发育过程,以及以这类蛋白酶为靶标,建立新型、高效、安全的杀虫剂筛选模型都具有重要的意义。主要研究结果如下: (1)根据已报道的绿僵菌PR1A基因保守序列设计引物,从绿僵菌CQMa102中克隆PR1A基因,其DNA序列、mRNA序列和编码蛋白的GenBank登录号分别为:AY839935,EF627449和ABR20899。其DNA序列全长1571 bp,cDNA序列全长1319 bp,其中包含一个1173 bp的开放阅读框和一个146 bp的3’端非编码区,开放阅读框编码一个含390个氨基酸序列的蛋白。根据同源序列比对以及序列分析结果,表明PR1A属于类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶(subtilisin-like serine protease,SLSP)家族。通过与来源于丝状真菌、酵母、细菌、蓝细菌、无脊椎动物及脊椎动物的16种SLSP构建同源树和系统发育树分析,表明CQMa102 PR1A与丝状真菌的SLSP具有非常高的同源性和很近的进化关系,而且与绿僵菌Metarhizium anisopliae var. acridum strain ARSEF 324 PR1A同源性高达99%。同时,我们用CQMa102 PR1A基因构建毕赤酵母分泌表达载体,并成功实现在毕赤酵母P. pastoris KM71中的分泌表达。用KM71原始菌株和pPIC9K空载体转化菌株作为对照,对重组菌株KM71/pPIC9K-PR1A表达产物进行分析。SDS-PAGE和Western blot都显示,在目标位置26 kDa大小附近新增加一条带,且与来源于绿僵菌的天然蛋白大小相同。另外,表达产物具有显著的对PR1特异底物活性、总蛋白酶活性以及对蝗虫壳蛋白的降解活性。这些研究结果表明,我们成功克隆到CQMa102 PR1A基因,且通过功能表达证明该基因编码蛋白具有降解蝗虫壳蛋白的功能。 (2)对来源于昆虫的类胰蛋白酶和丝氨酸蛋白酶氨基酸序列进行比对分析,根据保守区域设计两对嵌套简并引物。选取东亚飞蝗五龄幼虫MFP活性增加最快时期的虫体提取mRNA,进行反转录,用所设计的简并引物进行PCR扩增,克隆到一种新的蜕液蛋白酶基因,命名为Lm-TSP,其cDNA序列及推导的氨基酸序列GenBank登录号分别为:EF081255和ABN13876。cDNA序列全长1587 bp,其中包含一个735 bp的开放阅读框和一个852 bp的3’端非编码区,开放阅读框编码一个含244个氨基酸序列的蛋白。根据同源性搜索比对以及序列分析,表明Lm-TSP属于类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶(trypsin-like serine protease,TLSP)家族。通过与来源于昆虫、蛛形纲动物、哺乳动物和细菌的14种TLSP构建同源树和系统发育树分析,表明Lm-TSP与来源于昆虫的TLSP有较高的同源性和很近的进化关系,而且与来源于昆虫赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的TLSP同源性高达82%。RNAi研究结果表明,Lm-TSP基因的沉默将引起东亚飞蝗从四龄幼虫到五龄幼虫,和从五龄幼虫到成虫蜕皮功能的丧失,这说明Lm-TSP在东亚飞蝗蜕皮过程中起着重要作用。而且Lm-TSP基因的沉默同时会引起蜕液中总蛋白酶活性、特异蛋白酶活性和壳蛋白降解活性的急剧降低,继而引起对昆虫老表皮降解功能的缺失,最终导致昆虫不能蜕皮而死亡。这些结果表明Lm-TSP与东亚飞蝗蜕皮过程相关,是与昆虫蜕皮功能相关的第一个蛋白酶基因。 (3)建立起了比较完善的东亚飞蝗幼虫RNAi(larvae RNAi)体系。
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S476.1

手机知网App
【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 高书坤;东亚飞蝗蜕皮相关基因Lm-TSP功能分析及其可变剪接体克隆[D];重庆大学;2010年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前9条
1 樊美珍,李增智;营养物和培养条件对虫生真菌附着胞形成的影响[J];安徽农业大学学报;1994年02期
2 林华峰;虫生真菌研究进展(综述)[J];安徽农业大学学报;1998年03期
3 崔大祥,阎小君,苏成芝;采用改进的差示PCR技术分离胃癌差异表达基因及其临床意义(英文)[J];第四军医大学学报;1998年06期
4 李文华,王中康,殷幼平,夏玉先,彭国雄;理化因子对白僵菌附着胞形成的影响[J];重庆大学学报(自然科学版);2004年02期
5 蒋琳,马承铸;生物农药研究进展(综述)[J];上海农业学报;2000年S1期
6 陈历明,唐建国;分子内分子伴侣──Pro肽在蛋白质折叠中的作用[J];生命科学;2002年01期
7 单志萍,孟妤,姜文侯;丝状真菌三孢布拉霉DNA的提取研究[J];生物技术;2001年03期
8 王海川,尤民生;绿僵菌对昆虫的入侵机理[J];微生物学通报;1999年01期
9 翟锦彬,黄秀梨,许萍;杀虫真菌──球孢白僵菌的昆虫致病机理研究近况[J];微生物学通报;1995年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郝林华,陈靠山;多功能生物制剂对农作物光合作用的影响[J];山东农业科学;2005年05期
2 尹慧道;施佩璜;沈宗海;贾德芳;李文英;;低氧—低磷化铝熏蒸杀虫研究[J];安徽大学学报(自然科学版);1993年04期
3 韦传宝;贾玉成;杜宇;;芋花叶病毒检测试剂盒的研制[J];安徽大学学报(自然科学版);2009年04期
4 张运锋;黄光和;李希国;谭学林;;普通菜豆农艺性状相关性分析及主成分分析[J];安徽农学通报;2008年07期
5 范瑛阁,曹远银;微生物源农药的研究进展[J];安徽农业科学;2005年07期
6 尹荣焕;尹荣兰;杨玉英;潘树德;苏振山;白文林;;PCR技术检测熟肉制品中沙门氏菌的研究[J];安徽农业科学;2006年02期
7 王国昌;余昊;张育平;;石榴茎窗蛾致病性白僵菌的初步研究[J];安徽农业科学;2006年05期
8 韩芬霞;;猪肝脏基因组DNA提取与纯化的研究[J];安徽农业科学;2006年16期
9 孔琼;袁盛勇;张虹;李正跃;陈斌;朱春燕;;蜡蚧轮枝菌与农药混配防治甘蓝蚜的研究[J];安徽农业科学;2007年01期
10 刘开华;王三保;邢淑婕;;食品中金黄色葡萄球菌的PCR检测[J];安徽农业科学;2007年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 徐义流;张绍铃;;梨活体花柱内花粉RNA的降解[A];食品安全的理论与实践——安徽食品安全博士科技论坛论文集[C];2005年
2 林华峰;李茂业;谢鹏;;菜青虫一种致病真菌的生物学及毒力研究[A];现代农业理论与实践——安徽现代农业博士科技论坛论文集[C];2007年
3 冯明光;;影响我国真菌杀虫剂产业化进程的技术与社会因素[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第五卷)[C];2003年
4 王中康;殷幼平;彭国雄;夏玉先;;杀虫真菌功能基因克隆和菌株改良研究进展[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第五卷)[C];2003年
5 李文华;王中康;殷幼平;;虫生真菌附着胞研究进展[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第五卷)[C];2003年
6 王中康;李文华;夏玉先;殷幼平;;影响金龟子绿僵菌附着胞形成的理化因子研究[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第五卷)[C];2003年
7 殷凤鸣;秦长生;何雪香;陈权才;;绿僵菌防治不同种蝗虫的效果试验[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第五卷)[C];2003年
8 何学友;黄金水;蔡福水;杨希;陈德兰;康文通;;不同球孢白僵菌菌株对天牛致病力的测定[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第五卷)[C];2003年
9 张爱民;薛建平;;药用植物源杀虫剂的研究进展[A];中医药理论与应用研究——安徽中医药继承与创新博士科技论坛论文集[C];2008年
10 王小欣;;一株杀虫真菌的分离和特性研究[A];2009’环保农药新技术、新产品暨生物农药技术研讨会论文集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张青婵;A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D];山东农业大学;2010年
2 张升祥;家蚕气味结合蛋白基因的研究[D];山东农业大学;2009年
3 李振东;东祁连山高寒草地优势植物内生细菌多样性研究[D];甘肃农业大学;2010年
4 姚小磊;基于TGF-β1与Bcl-2的抗干眼症中药高通量筛选体系的建立[D];湖南中医药大学;2010年
5 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
6 金少锋;基于金龟子绿僵菌和低剂量扑虱灵协同作用的稻飞虱防治替代策略研究[D];浙江大学;2010年
7 谢雪钦;球孢白僵菌超氧化物岐化酶(SODs)的基因克隆、鉴定及功能分析[D];浙江大学;2010年
8 秦毅;表达苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aal的球孢白僵菌工程菌株的构建及其对斜纹夜蛾幼虫的肠道与体壁侵染力[D];浙江大学;2010年
9 刘倩;胞内海藻糖对球孢白僵菌耐热力的贡献及其代谢相关基因的功能鉴定[D];浙江大学;2010年
10 温武军;鲤抗菌肽基因的克隆及其功能研究[D];山东师范大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 兰楠;利用天南星科凝集素构建内生工程真菌及其抗虫防病效果研究[D];华中农业大学;2010年
2 郑瑜;银杏核心种质构建初探[D];华中农业大学;2010年
3 曹晶;风疹病毒(RV)包膜糖蛋白E1特异基因片段的原核表达[D];南京医科大学;2009年
4 胡娟;几种生物农药对稻纵卷叶螟和稻飞虱的防治作用研究[D];安徽农业大学;2010年
5 刘苏;褐飞虱高毒力真菌筛选及固相发酵培养基组分优化[D];安徽农业大学;2010年
6 罗素娟;家蚕细胞周期依赖性蛋白激酶家族(CDK)的研究[D];浙江理工大学;2010年
7 陈晓平;家蚕30kD载脂蛋白19G1的表达和功能的初步研究[D];浙江理工大学;2010年
8 刘静;家蚕BmycaCR基因的原核表达和亚细胞定位研究[D];浙江理工大学;2010年
9 俞云峰;不同惰性载体上发酵产蜡蚧轮枝菌分生孢子生物特性的研究[D];浙江理工大学;2010年
10 葛红秀;家蚕钙磷蛋白(BmCAPS)的原核表达及定位分析[D];浙江理工大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 胡景江,樊美珍;球孢白僵菌胞外蛋白酶与其毒力的关系[J];安徽农业大学学报;1996年03期
2 郭恩恩;李胜;曹阳;;昆虫蜕皮的激素调控网络[J];蚕业科学;2008年02期
3 姚春阳;沈旭;庄金秋;;巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展[J];黑龙江畜牧兽医;2008年02期
4 许可,唐明,沈璐辉,徐卫华;昆虫蜕皮行为的生理生化和分子生物学研究进展[J];昆虫学报;2001年02期
5 赵小凡,蒋晓娟,徐筠娉,刘延荷,王金星;棉铃虫蜕皮调节转录因子在大肠杆菌中的重组表达及其包涵体纯化[J];昆虫学报;2004年03期
6 李洪波;夏玉先;;昆虫神经毒素BjαIT的表达及杀虫活性[J];昆虫学报;2008年11期
7 赵小凡;;昆虫蜕皮的分子机理及应用[J];昆虫知识;2007年03期
8 王善治,袁榴娣;SR蛋白研究进展[J];东南大学学报(医学版);2003年04期
9 郭小泽;;毕赤酵母表达系统及其在水产领域的应用[J];内陆水产;2008年02期
10 李强;朱砺;李学伟;赵华;;猪髓样分化因子88在毕赤酵母中的表达和纯化[J];四川畜牧兽医;2009年12期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 樊美珍,李增智;营养物和培养条件对虫生真菌附着胞形成的影响[J];安徽农业大学学报;1994年02期
2 林华峰;虫生真菌研究进展(综述)[J];安徽农业大学学报;1998年03期
3 黄秀梨;项伯衡;;白僵菌Beauveria bassiana的几丁质酶[J];北京师范大学学报(自然科学版);1981年02期
4 朱衡,瞿峰,朱立煌;利用氯化苄提取适于分子生物学分析的真菌 DNA[J];真菌学报;1994年01期
5 樊美珍,黄勃,王建林,王滨;几种虫生真菌附着胞的荧光显微及扫描电镜观察[J];菌物系统;1999年03期
6 林华峰,黄勃,李增智,胡萃;白僵菌在松毛虫体上宿存侵染的电镜扫描观察[J];菌物系统;1998年04期
7 姚康,杨长举;用山苍子芳香油防治蚕豆象[J];昆虫学报;1984年02期
8 沈寅初;;农用抗生素的新进展[J];农药译丛;1993年06期
9 屠豫钦;天然源农药的研究利用—机遇与问题[J];世界农药;1999年04期
10 单志萍,姜文候,孟妤;丝状真菌三孢布拉霉原生质体制备及再生条件的研究[J];江苏食品与发酵;1999年04期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张志武,谢建军,史滟预,张保严,谢志庚,李顺功,吴福海;20%杀蝗绿僵菌油剂防治东亚飞蝗田间药效试验[J];天津农林科技;2004年01期
2 刘宗祥,常明,代建聪,谭成虎,王俊梅,钟自琦,尹翠琴,唐建明,贺宝宝;绿僵菌防治草原蝗虫田间效果[J];草业科学;2004年08期
3 王海川,尤民生;绿僵菌分生孢子对寄主附着机制的研究进展[J];昆虫知识;1999年03期
4 张泽华,高松,张刚应,王扬,杨宝东,张卓然,郑双悦,王梦龙;应用绿僵菌油剂防治内蒙草原蝗虫的效果[J];中国生物防治;2000年02期
5 张丽萍,程辉彩,王迎春,董超,赵芊,田连生,关丽杰;绿僵菌固体生产条件的研究[J];农药;2002年07期
6 李永丹,覃晓春,赵朝阳,王丽英;亚洲小车蝗痘病毒对绿僵菌治蝗的增效作用[J];中国生物防治;2003年03期
7 熊道稚,吴春;绿僵菌防治甘薯华叶虫[J];植物保护;1981年03期
8 张刚应,杨怀文;用绿僵菌防治德国小蠊[J];植保技术与推广;1995年06期
9 肖育贵,郭亨孝;绿僵菌防治鞭角华扁叶蜂试验研究[J];四川林业科技;2000年03期
10 王音,雷仲仁,张青文,问锦曾;绿僵菌侵染小菜蛾体表过程的显微观察[J];昆虫学报;2005年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王兵;康前进;徐吉庆;卢玉珍;郑鹏;商艳芳;白林泉;王成树;;绿僵菌破坏素的生物合成和杀虫毒力研究[A];中国菌物学会第五届会员代表大会暨2011年学术年会论文摘要集[C];2011年
2 刘作易;;澳洲对绿僵菌的研究及其应用[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第四卷)[C];1996年
3 武觐文;杨莉;万勇;;脂类物质对绿僵菌侵染虫体的影响[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第二卷)[C];1991年
4 张礼生;张泽华;高松;农向群;;绿僵菌生物农药研究进展[A];第四届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第三届生物农药研讨会论文集[C];2006年
5 林立辉;付廷荣;;几种培养基对绿僵菌生长及产毒能力的影响[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第一卷)[C];1986年
6 樊美珍;胡锦江;郭超;杜希科;;绿僵菌不同世代酯酶同工酶脂肪酸等与其毒力关系的初步研究[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第二卷)[C];1991年
7 刘辉;王世平;董树新;王虎;樊美珍;;利用绿僵菌防治桃小食心虫[A];中国虫生真菌研究与应用[C];1991年
8 樊美珍;李建乾;郭超;哈米提·哈山;;绿僵菌在土壤中宿存形式和存活时间的测定[A];全国生物防治学术讨论会论文集[C];1991年
9 马维思;徐江;乔海莉;覃荣敏;陈君;李向明;;广东化橘红GAP基地土壤中绿僵菌的分离与鉴定[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
10 农向群;李存焕;张泽华;魏海燕;;绿僵菌防治高尔夫草坪蛴螬的效果[A];第四届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第三届生物农药研讨会论文集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王浩;杀蝗绿僵菌田间示范4万亩[N];农资导报;2004年
2 本报记者 张红;引进绿僵菌只是开始[N];人民日报海外版;2009年
3 本报记者 张红;青出于蓝而胜于蓝[N];人民日报海外版;2003年
4 王中康;杀蝗绿僵菌油悬浮剂 今年田间示范4万亩[N];农民日报;2004年
5 邓建华;绿僵菌也能杀椰心叶甲[N];海南日报;2004年
6 邓建华;出战椰心叶甲添“绿将军”[N];海南日报;2004年
7 记者 王宏伟;河西走廊千万亩草场遭遇蝗灾[N];中国化工报;2006年
8 记者  江娜;我国科技治蝗项目取得较大进展[N];农民日报;2006年
9 记者 范建 实习生 何梦媛;农业科技提升行动:打响飞蝗防治这一仗[N];科技日报;2006年
10 记者 任平;我省蝗灾今年轻于往年[N];山西科技报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 周刚;绿僵菌多菌灵抗性评价与罗伯茨绿僵菌组氨酸激酶及腺苷酸环化酶的生物学功能分析[D];浙江大学;2011年
2 王音;绿僵菌LD65和LF68菌株生物学特性及对小菜蛾的致病机理[D];中国农业大学;2005年
3 贾春生;利用绿僵菌防治舍恩菲尔德异丽金龟研究[D];东北林业大学;2002年
4 王九辉;绿僵菌MA3对椰心叶甲的致病性研究[D];华南热带农业大学;2007年
5 岳梅;东亚飞蝗体温调节能力及其与绿僵菌致病性的关系研究[D];中国农业科学院;2009年
6 王达;对光肩星天牛幼虫高致病力绿僵菌菌株筛选及其致病机理研究[D];河北农业大学;2009年
7 彭国雄;杀蝗绿僵菌生物农药研制及其应用技术研究[D];重庆大学;2008年
8 蔡泽骏;绿僵菌海藻糖合成酶1基因克隆、表达及酶学特性研究[D];重庆大学;2009年
9 刘作易;虫草属及其无性型关系研究[D];华中农业大学;1999年
10 张伟;绿僵菌和蝗虫中具有降解昆虫体壁功能蛋白酶基因的分离、克隆及功能研究[D];重庆大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 韩小勇;河北地区土壤绿僵菌特性研究[D];河北农业大学;2010年
2 李敏;绿僵菌磷酸甘露糖异构酶基因的克隆及功能分析[D];重庆大学;2011年
3 崔倩倩;防治小菜蛾高效绿僵菌工程菌的构建[D];中国农业科学院;2013年
4 李凯;绿僵菌Mamrd1基因的克隆与功能分析[D];重庆大学;2011年
5 明月;绿僵菌丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶基因MaSnf1和MaHog1的克隆及功能分析[D];重庆大学;2013年
6 罗莎;绿僵菌四次跨膜蛋白MaPls1基因的克隆与功能研究[D];重庆大学;2013年
7 黄冬如;绿僵菌对东亚飞蝗致病机理的初步研究[D];湖南农业大学;2004年
8 郭艳琼;绿僵菌对马铃薯瓢虫幼虫防效及杀虫机理的初步研究[D];山西农业大学;2003年
9 汪雅琴;fmo同源基因在绿僵菌生长、发育及致病过程中的作用研究[D];重庆理工大学;2013年
10 张孝彬;绿僵菌葡聚糖转移酶Mwg1的基因功能研究[D];重庆理工大学;2013年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026