收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

纤维堆囊菌基因转化体系建立及埃博霉素生物发酵和纯化工艺研究

涂昀  
【摘要】: 来源于纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)二级代谢产物的埃博霉素是一种新型抗癌剂,机制与紫杉醇相似,能够稳定微管蛋白,抑制细胞的分裂和增殖。但由于它具有更好的水溶性、简单的化学结构,并且对紫杉醇的耐受细胞表现出很大活性以及不会象紫杉醇那样产生内毒素等的优点,激发了科研人员和制药公司的极大热情,成为化学界、生物界和临床医学研究的热点。在化学全合成、生物发酵、生物的合成改造、活性与构象关系的推导、基因簇异源表达等方面取得了卓越的成就。当前已经有5种埃博霉素类活性物进入II期和III期临床评估,作为新的第三代化疗药物走向市场指日可待。 但作为埃博霉素的来源菌—纤维堆囊菌,因为传代时间长、菌株特异性强、耐药范围广、聚集生长和可使用的分子标记少等不利因素,使得对纤维堆囊菌基因操作极为困难,对埃博霉素合成的基因调控、操纵子的工作方式,转录的控速部分等问题的认知近于空白。除此之外,到目前为止人们还没有在纤维堆囊菌乃至粘细菌中找到一个能自主复制,独立于宿主细胞的质粒。以上种种原因成为限制对纤维堆囊菌所产生的丰富的、具有生物活性二级代谢产物进行研究和利用的瓶颈。 本文以埃博霉素的阳性菌株——S. cellulosum So ce90为对象,研究了该菌株的发酵条件和纯化的工艺流程,并通过利用广谱可移动质粒pRK415构建含有EpoPro片段(埃博霉素合成酶基因中epoA起始密码子(GTG)上游(-890~-1bp)区域)和荧光蛋白基因的pRP-GFP载体,建立了针对该菌株的基因转化体系。主要结论如下: ①以高效液相色谱为检测手段,埃博霉素的产量为指标,比较9种不同培养基,筛选出适合S. cellulosum So ce90的培养基和发酵条件。适宜培养基(II号发酵液)的主要成分是:2g/L脱脂大豆粉,10g/L马铃薯淀粉,8g/L脱脂奶粉,2g/L酵母浸膏,2g/L葡萄糖,8 mg/L Na-FeIII-EDTA,1 g/L MgSO4 ? 7H2O,1g/L CaCl2 ? 2H2O,11.5g/L HEPES,2%(v/v)树脂XAD-16。用KOH调节pH值为7.4。最适种子培养液采用在30oC,180rpm培养4天得到的G52发酵液。以5%的接种量添加到II号发酵液中,发酵8天达到最高产率。 ②埃博霉素分离和纯化工艺是首先采用100%异丙醇将埃博霉素从树脂中洗脱出来,通过乙酸乙脂和石油醚(1:1)的混合有机液进行萃取后,SOURCETM 30反相层析,最后利用C18反相半制备柱,高效液相制备得到埃博霉素A和B。经质谱,紫外光谱和红外光谱等验证结构,与文献报道一致。 ③利用结合转移的方式将载体pRP-GFP从E.coli S17-1中导入到S. cellulosum So ce90中,在四环素(50μg/ml)和卡那霉素(10μg/ml)的选择压力下筛选转化子。对转化子的Southern杂交证明该质粒在宿主菌中并没有被整合到宿主菌的基因组上。这是首次发现能在粘细菌中独立存在且自主复制的质粒。因此,此质粒将为分离及分析埃博霉素代谢相关基因提供有力而便利的工具,从这个意义上说,这个质粒的获得是对S. cellulosum So ce90的遗传及分子生物学研究上取得的突破。 ④结合转移的效率主要和融合时间相关,而融合前的热击并不影响转化率。最佳的融合时间是60-65h,转移效率达到9×10-6。但是,当融合时间高于70小时或低于40小时,获得转化子极少。 ⑤转化子稳定性实验表明,当宿主细胞维持在有四环素的环境中时,pRP-GFP能长期存在,并且稳定表达;而在没有抗生素的压力下,子代中质粒将出现严重的丢失,繁殖到50代的时候,细胞中质粒的含有率仅仅达到73%。 ⑥采用荧光显微镜能观察到转化子呈现绿色荧光。这是荧光蛋白首次被导入到纤维堆囊菌中,并且使之得到很好表达,为纤维堆囊菌的分子操纵提供了一个快捷而便利的分子标记。 ⑦通过比较载体pRK415-GFP(不含EpoPro片段)和pRP-GFP在宿主菌中GFP的表达与否,证明了EpoPro具有启动活性。这是首次得到埃博霉素合成酶基因上具有启动活性的片段,为进一步分析埃博霉素的操纵子及其基因的功能调节等研究打下基础。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 罗立新;陆一鸣;潘力;;NTG诱变选育埃博霉素高产菌株的研究[J];现代食品科技;2007年03期
2 孟凡欣;郭伟良;逯家辉;杜林娜;李又欣;滕利荣;;纤维堆囊菌发酵液中埃博霉素含量的HPLC法分析[J];高等学校化学学报;2009年10期
3 刘斯淼;杜林娜;郭伟良;孟凡欣;滕利荣;;均匀设计法优化埃博霉素树脂原位提取条件[J];中国医药工业杂志;2010年05期
4 阎家麒;高荣;谢建平;周彬;;抗癌新药埃博霉素的研究与开发(二)[J];精细与专用化学品;2008年06期
5 韩莉莉;卢育新;王赫;王延亮;丁小军;刘丽华;张庆林;;固相萃取-液相色谱法检测发酵液中埃博霉素[J];中国生化药物杂志;2009年01期
6 诸景光;罗立新;;基于响应面法的Epothilone发酵优化[J];现代食品科技;2009年07期
7 阎家麒;高荣;谢建平;周彬;;抗癌新药埃博霉素的研究与开发(一)[J];精细与专用化学品;2008年05期
8 ;山东大学两项生物技术通过鉴定[J];辽宁化工;2002年12期
9 刘贤贤;覃雯;郑炎松;;埃博霉素的合成[J];有机化学;2007年03期
10 刘新利;胡玮;扈锡涛;韩冠君;夏志洁;龚国利;李越中;;纤维堆囊菌产物生物学活性的研究[J];山东轻工业学院学报(自然科学版);2007年02期
11 孙鹤;胡玮;王纵横;李越中;赵桂龙;王建武;;两个埃博霉素生物合成中间体修饰化合物的合成[J];有机化学;2008年04期
12 李越中;纤维堆囊菌Soce90菌株发酵合成新型抗癌物质epothilones的营养控制[J];中国抗生素杂志;1998年06期
13 冬青;中间体及精细化工最新工业成果集粹[J];化工中间体(市场快讯版);2002年23期
14 罗立新,汪薇,潘力;粘细菌发酵生产新型微生物药物的初步研究[J];食品与发酵工业;2005年07期
15 荣辉;黄惠琴;鲍时翔;;异源生物合成聚酮化合物的研究进展[J];天然产物研究与开发;2007年06期
16 ;医药及兽药[J];精细与专用化学品;2004年01期
17 王延亮;卢育新;丁小军;王赫;张庆林;;高效液相色谱法分析微生物代谢物埃博霉素B的含量[J];中国生化药物杂志;2008年03期
18 ;科技动态[J];现代化工;2003年01期
19 ;2008年《精细与专用化学品》总目录[J];精细与专用化学品;2008年24期
20 阎家麒;;埃博霉素的生物合成[J];药物生物技术;2009年02期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 李曙光;李鹏飞;黎志凤;刘红;李越中;;纤维堆囊菌So0157-2中埃博霉素A糖基转移酶的预测与分离[A];第二届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会论文摘要集[C];2010年
2 朱丽萍;黎志凤;;So0157-2埃博霉素生物合成基因簇启动子预测及功能分析[A];第二届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会论文摘要集[C];2010年
3 程媛媛;钱云开;黎志凤;刘红;吴志红;李越中;;纤维堆囊菌So0157-2单酰基甘油酰基转移酶的基因克隆、序列分析及异源表达[A];2010年第四届全国微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 曹文瑞;纤维堆囊菌GSUV3-205发酵生产埃博霉素过程中关键因子的探索及优化[D];山东大学;2011年
2 钱云开;纤维堆囊菌胞内脂类内含物成分、形成及其对埃博霉素生物合成的影响[D];山东大学;2010年
3 孟凡欣;埃博霉素高产菌株选育、发酵条件优化及抗肿瘤活性研究[D];吉林大学;2009年
4 涂昀;纤维堆囊菌基因转化体系建立及埃博霉素生物发酵和纯化工艺研究[D];重庆大学;2007年
5 黎志凤;纤维堆囊菌埃博霉素生物合成基因簇与酮基合酶基因的克隆与分析[D];山东大学;2006年
6 夏志洁;纤维堆囊菌遗传操作体系建立及其在埃博霉素生物合成改造中的应用[D];山东大学;2007年
7 郭文杰;粘细菌的筛选及其产生的新型抗肿瘤抗生素[D];江南大学;2007年
8 王淑云;纤维堆囊菌So9733-1纤维素酶复合体的蛋白质组学分析与酶基因的克隆、表征[D];山东大学;2011年
9 侯配斌;粘细菌纤维堆囊菌降解纤维素多酶复合体的确证和性质分析[D];山东大学;2006年
10 张鹏翼;双选择抗生素影响大肠杆菌间质粒接合转移的分子机制暨纤维堆囊菌So0157-2表达蛋白质组学分析[D];山东大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王婷;纤维堆囊菌合成埃博霉素几个关键问题的研究[D];山东轻工业学院;2011年
2 高海燕;高产埃博霉素纤维堆囊菌的genome shuffling选育研究[D];山东轻工业学院;2012年
3 李鹏飞;纤维堆囊菌的生物多样性及其株系间的竞争互助关系[D];山东大学;2010年
4 陆震;埃博霉素生产菌株选育及埃博霉素抑瘤活性研究[D];山东轻工业学院;2011年
5 葛瑞娟;埃博霉素内酰胺的合成研究及类似物结构修饰[D];大连理工大学;2011年
6 王路;纤维堆囊菌So0157-2埃博霉素合成相关调控蛋白的分离和鉴定[D];山东大学;2012年
7 王堃;埃博霉素B的制备分析及PEG修饰[D];安徽医科大学;2012年
8 王赫;埃博霉素B的制备工艺研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2006年
9 王延亮;Epo A、B的制备及微生物转化研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
10 田晓翔;纤维堆囊菌纤维素酶基因的生物信息学分析、异源表达及性质研究[D];山东大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前4条
1 通讯员 杨寅 陶安庆;永安洲一项目获省扶持[N];泰州日报;2008年
2 记者 焦莉莉;六项目入围省专利项目[N];石家庄日报;2010年
3 陈道平;海正药业上半年获7项发明专利[N];台州日报;2010年
4 记者 焦莉莉;我市六项目荣获省专利战略成果奖[N];石家庄日报;2011年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978