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《重庆大学》 2007年
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绿僵菌侵染蝗虫差异糖蛋白及其酪氨酸蛋白磷酸酶在寄主血淋巴中的靶标蛋白分析

王楚桃  
【摘要】: 金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在东亚飞蝗防治中起着重要作用。与化学农药相比,真菌杀虫剂尽管安全,无环境污染,但存在着杀虫速率慢的缺点,这在很大程度上阻碍了绿僵菌杀蝗剂的应用。研究病原真菌侵染过程中,昆虫与病原真菌相互作用,探索昆虫的防御机制和病原真菌的致病机理可为发展新型高效真菌杀虫剂提供依据。 病原真菌侵入昆虫血腔后到寄主死亡前,是决定病原真菌是否能杀死寄主的关键时期,病原真菌与寄主两者间发生着非常复杂的相互作用。一方面,病原真菌通过释放破坏素以降低寄主的细胞防御反应,分泌葡萄糖苷酶、海藻糖酶和酸性磷酸酶等水解酶类以分解利用寄主体内的营养物质,从而耗竭寄主体内营养;另一方面,寄主也会通过细胞和体液免疫反应积极抵御病原真菌的侵染。 糖蛋白和磷酸化蛋白是广泛分布在生物体内的两种主要的翻译后修饰蛋白。这两种蛋白都在生物体的多种生命活动过程中起着重要的作用。近年来,针对糖蛋白和磷酸化蛋白的研究,特别是一些与疾病和免疫有关的糖蛋白研究已成热点,为认识一些疾病的分子机理奠定了理论基础,并为通过基因工程手段治疗这些疾病提供了作用靶标。 本研究以东亚飞蝗和金龟子绿僵菌(M. anisopliae)菌株CQMa102为研究材料,首次用高通量、高分辨率的双向电泳技术在感病昆虫血淋巴中筛选出了13个差异表达糖蛋白点。通过对差异糖蛋白肽质量指纹图谱和肽段de novo测序分析,鉴定出了其中的3个蛋白。同时利用双向电泳技术和串联质谱技术,在东亚飞蝗血淋巴磷酸化蛋白中找到了2个绿僵菌PTPase靶标磷酸化蛋白。通过关于这3个糖蛋白和2个磷酸化蛋白的研究报道,分析推测了它们的可能生理功能和在昆虫与寄主相互作用过程中的可能作用。为了解病原真菌的致病机理和昆虫的防御机制提供了理论依据,也为进一步研究这些蛋白在绿僵菌侵染东亚飞蝗过程中的确切作用奠定了基础。主要研究结果如下: ①东亚飞蝗健康雄成虫在羽化后5d到13d这段时间,血淋巴内的游离氨基酸含量基本衡定,保持在125μg/ml左右,而CQMa102侵染的东亚飞蝗,随侵染时间延长,血淋巴内游离氨基酸含量不断提高,到感染末期,游离氨基酸含量急剧提高,达到454.5μg/ml。 ②东亚飞蝗健康雄成虫在羽化后5d到13d这段时间,血淋巴内的蛋白质含量基本衡定,保持在15.25mg/ml左右;而CQMa102侵染的东亚飞蝗血淋巴中的蛋白质含量不断降低,到第8d,其含量只有11.85mg/ml。 ③病原真菌侵染的前4d,血淋巴总蛋白SDS-PAGE表达谱没有明显变化,而在感染后第6d,昆虫血淋巴蛋白谱发生了显著变化,感染昆虫血淋巴较对照明显新增了3条蛋白谱带,1条蛋白谱带较对照明显减弱。 ④用Con A-Sepharose 4B分离纯化蝗虫血淋巴糖蛋白,通过对照与感病昆虫血淋巴糖蛋白双向电泳图谱比较分析,筛选出13个差异表达糖蛋白点,其中9个表达水平发生上调,4个蛋白表达下调。 ⑤用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得了10个差异蛋白的清晰肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)。但由于东亚飞蝗蛋白基因组和蛋白质序列信息量较少,这些肽质量指纹数据均未能通过MASCOT搜索引擎在NCBI数据库中搜索到显著差异的检索结果。 ⑥通过质谱肽段de novo测序,获得了4个差异蛋白的13个肽段氨基酸序列,用生物信息学方法,其中的3个被鉴定为transferrin( SGLDDVLSLDGGEALTAVR ) , Apolipophorin precursor protein(EIVAEGLLIDDNNEK)和hexamerin storage protein(YDAYGNEMTLDEAR)。已有的研究资料表明, transferrin和hexamerin storage protein两个蛋白与昆虫的免疫反应有关。其它10个差异表达糖蛋白仍为未知蛋白。 ⑦将蝗虫血淋巴用磷酸化蛋白亲和层析后得到的磷酸化蛋白用纯化的绿僵菌PTPase作用,作用后的蛋白样品经双向电泳比较分析得到两个差异点。这两个蛋白点用串联质谱分析后比对发现其中一点与Toll-like receptor同源性好,而Toll-like receptor是介导昆虫产生免疫反应信号传导物质,暗示该磷酸酶具有干扰蝗虫体内信号传导的能力。另一点与Golgi autoantigen ,golgin subfamily A member 4 (Trans-Golgi p230)同源性好,而该类蛋白与动物的自身免疫疾病和有些蛋白特别是糖蛋白从高尔基体的外运有关,暗示该磷酸酶可能通过对该蛋白去磷酸化,阻碍某些糖蛋白的外运,尤其是某些重要的免疫糖蛋白,降低昆虫的免疫力。
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