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《重庆大学》 2010年
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抑制Dicer表达对人类细胞染色质结构及相关生理功能的影响

唐开福  
【摘要】: Dicer是核糖核酸酶III家族成员之一,在RNAi途径中起着关键作用,具有重要的生物学功能:是miRNA和siRNA生物合成过程中的关键酶,能够调节DNA甲基化和组蛋白修饰,参与维持基因组的稳定性,参与DNA复制时间先后顺序和细胞衰老的调节等等。在小鼠中敲除Dicer导致多方面的异常,包括发育早期干细胞群不能维持、T细胞和B细胞发育异常、卵母细胞有丝分裂停滞、扩张性心肌病、原始生殖细胞和精子发育不良、肾小球疾病、视网膜退化、神经系统疾病等等。 在脊椎动物中,RNAi依赖的染色质沉默不仅仅局限于着丝粒区。为了研究RNAi途径对印迹基因染色质结构的影响,我们在HEK293细胞中抑制Dicer的表达。结果发现干扰Dicer的表达能够诱导PHLDA2(11p15.5处印迹基因区域中的基因之一)的表达上调,该基因位点的组蛋白H3K9乙酰化水平增高,提示该基因的染色质被活化,但是该基因的DNA甲基化水平没有受到影响。同时,我们也发现在血清饥饿或接触抑制的HEK293细胞中PHLDA2的表达明显降低,说明PHLDA2的上调不是敲除Dicer诱导生长抑制的结果,而是染色质活化的结果。 染色质的结构与基因组的稳定性密切相关,在果蝇中Dicer2的缺失通过引起异染色质的解凝聚诱导染色体外环状DNA (eccDNA)的形成;另外DNA损伤修复通路也可能与Dicer2突变细胞中的ecc DNA形成有关。DNA复制时间的先后顺序与染色质结构密切相关,一般来说,常染色质先复制,异染色质后复制。在Dicer缺失的胚胎干细胞中,卫星DNA的复制时间先后顺序发生紊乱,DNA复制时间先后顺序紊乱能诱发DNA损伤。作为基因组的免疫系统,RNAi通路可以抑制转座子的活动,Dicer缺失可能激活转座子,从而导致DNA损伤。为了研究Dicer缺失是否引起DNA损伤,我们用两个不同的siRNA在HEK293T和HepG2细胞中抑制Dicer的表达,结果表明抑制Dicer表达能够诱导DNA损伤,具体表现为:(1)与对照细胞相比,Dicer缺失细胞的γ-H2AX foci阳性率明显增加,复制蛋白A 70(RPA 70)的染色明显增强,并在细胞核中呈点状分布;(2)Dicer缺失细胞中检验点激酶1(Chk1)S345的磷酸化水平明显增加;(3)彗星电泳的结果直接表明,Dicer缺失能够诱导DNA损伤;(4)在Dicer缺失细胞中,一些与DNA损伤有关的基因,包括GADD45A、GADD45B、p21、BTG3、ATF3和EGR1的表达明显升高。 DNA损伤能够诱导天然免疫系统NKG2D配体的表达,抑制Dicer表达能够诱导DNA损伤。为了研究Dicer缺失能否上调NKG2D配体的表达,我们用定量RT-PCR和流式细胞仪检测了主要组织相容性复合物I相关分子A和B(MICA和MICB)的表达。结果表明,在Dicer缺失的细胞中,MICA和MICB的表达明显增加。Dicer缺失诱导的MICA和MICB表达能够被DNA损伤途径组分(包括ATM、ART和Chk1)的抑制剂阻断,说明MICA和MICB表达上调是Dicer缺失诱导DNA损伤的结果。MICA和MICB表达的上调导致HEK293T和HepG2细胞对自然杀伤细胞株NKL的杀伤作用更加敏感。 为了进一步证实异染色质解凝聚能够引起DNA损伤并诱导MICA和MICB的表达,我们用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂脱氧胞苷(5-aza-dC)处理HEK293T和HepG2细胞。5-aza-dC诱导DNA去甲基化和异染色质解凝聚,并诱导DNA损伤和MICB的表达上调。 Dicer缺失影响内皮细胞的迁移能力,在Dicer缺失的内皮细胞中,纤维粘连蛋白的表达明显增加。EGR1能够与纤维粘连蛋白的启动子结合,诱导纤维粘连蛋白表达,Dicer缺失能够诱导EGR1的表达,因此我们推测Dicer缺失可能通过EGR1诱导纤维粘连蛋白表达。为了证实这个假设,我们在HEK293T细胞中抑制Dicer的表达,结果发现Dicer缺失诱导EGR1依赖的纤维粘连表达增加,纤维粘连蛋白表达增加削弱了HEK293T细胞的迁移能力。另外,我们还发现在Dicer下调的HEK293T细胞中,抑制纤维粘连蛋白表达可诱导细胞凋亡。因此,我们推测纤维粘连蛋白表达增加可能是Dicer缺失的HEK293T细胞不发生凋亡的原因之一。 综上所述,我们提出这样一个模型:Dicer是异染色质形成所必须的,Dicer缺失导致染色质解凝聚,从而打乱了DNA复制时间的先后顺序,诱导DNA损伤;异染色质解凝聚能够激活转座元件,另外Dicer缺失也可能增加来源于转座元件的双链RNA的稳定性,因此提高转座子活性,从而导致DNA损伤。DNA损伤诱导EGR1表达,进而激活纤维粘连蛋白转录,纤维粘连蛋白表达上调能够抑制细胞的迁移能力。另外,DNA损伤还能诱导MICA和MICB的表达,从而导致Dicer缺失的细胞被免疫系统清除。
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