金龟子绿僵菌CQMa102致病相关基因CuAO的功能分析

【摘要】： 金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是在害虫生物防治中起着重要作用的一类重要的昆虫病原真菌。与化学农药相比,昆虫病原真菌开发的真菌杀虫剂作用时间持久、无环境污染、对非靶标生物安全,但也存在以下缺点阻碍真菌杀虫剂的应用:致死长时间,杀虫低效率,不稳定防效等,为解决这一问题,在分子水平上揭示昆虫病原真菌致病机理尤为重要。金龟子绿僵菌侵染寄主昆虫时,分生孢子通过分泌多种蛋白酶类降解昆虫体壁,并同时在体表萌发形成附着胞,附着胞的形成与分化在侵染过程中发挥着重要作用。金龟子绿僵菌首先穿透寄主体壁侵入体内,在血淋巴定殖,再分泌大量毒素并掠夺寄主营养致死寄主,最终是孢子在体内成功定殖的情况决定着侵染的结果。研究附着胞形成时期和血淋巴定殖阶段的特异表达基因和基因表达特征分析,对于研究昆虫病原真菌致病机理具有重要意义。 在张传博等利用消减杂交技术(SSH)构建了金龟子绿僵菌CQMa102绿僵菌在致病时期的特异表达基因的差减文库的基础上,我们选择了编号为S-14的金龟子绿僵菌CQMa102致病过程中高表达的EST序列进行研究,该EST序列长为448bp,该基因分别和马尔尼菲青霉CuAO(Peroxisomal copper amine oxidase)基因具有较高的同源性,利用本实验室构建的金龟子绿僵菌CQMa102基因组DNA文库,成功获取了CuAO基因的DNA全长;利用RNAi的方法研究了CuAO的功能。主要研究结果如下: ①利用本实验室构建的金龟子绿僵菌CQMa102基因组DNA文库,通过同源比对,获取了CuAO基因的DNA全长。将DNA序列与cDNA序列用bl2seq软件比对,结果表明:CuAO基因DNA全长2118bp,含有一个内含子,其中一个内含子(114bp-191bp)边界为GG….AC。 ②利用RNAi的方法对CuAO基因的功能进行研究。CuAO基因的干扰片段与RNA干扰载体(pbar-RNAi-gpd-trp)连接后,转化大肠杆菌,再用基因枪法转化金龟子绿僵菌CQMa102,经过PCR筛选,获得2个CuAO基因的干扰突变株。 ③分析了CuAO基因的35号干扰突变株在东亚飞蝗后翅上的产生附着胞的数量,在培养过程中,干扰突变株孢子仅有少数产生附着胞,而其余孢子则大量的匍匐状菌丝。野生株的产生附着胞的数量是干扰突变株的12.71倍。 ④对CuAO基因的干扰突变株孢子的毒力进行了测定,干扰突变株孢子的半致死时间和野生株孢子有显著差异。说明基因的干扰降低了孢子的毒力,推测CuAO基因影响金龟子绿僵菌CQMa102的毒力。