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《重庆大学》 2010年
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东亚飞蝗蜕皮相关基因Lm-TSP功能分析及其可变剪接体克隆

高书坤  
【摘要】: 蜕皮是昆虫生长发育过程中一种重要的生理行为,昆虫的体壁由于外表皮的硬化,形成外骨骼,硬化的外骨骼没有延展性,所以昆虫体躯的生长、发育都必须在周期性的蜕皮过程中进行。昆虫在蜕皮时不吃少动,对作物危害小,若不能正常蜕皮,幼虫则不能变为成虫,形成取食量降低、没有生命力或不能繁殖的畸形个体。因此,昆虫蜕皮过程一直是害虫控制研究的热点。研究昆虫蜕皮不仅有助于阐明昆虫蜕皮发育生理机制,也有助于寻找新的杀虫靶标。早期的昆虫蜕皮研究主要集中在蜕皮激素调控蜕皮调节转录因子表达以及蜕皮液中酶的纯化方面,而涉及蜕皮相关基因克隆及功能研究的报道较少。 本实验室张伟等以东亚飞蝗为研究对象,分离克隆了一个推测编码产物是类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶的基因,命名Lm-TSP,运用RNAi技术研究发现,注射Lm-TSP特异的dsRNA后,东亚飞蝗从四龄幼虫到五龄幼虫、从五龄幼虫到成虫蜕皮受阻,最终死亡。而且Lm-TSP基因沉默会引起蜕皮液蛋白酶活性和壳蛋白降解活性降低。这些结果表明Lm-TSP基因与东亚飞蝗蜕皮相关,推测该基因可作为杀蝗靶标,因此我们以该基因为研究对象,进一步分析验证其功能。分析该基因在五龄幼虫到成虫不同发育时期的表达情况以及在五龄幼虫不同组织器官中的表达情况;因为胚胎孵化过程也涉及蜕皮,我们也分析了该基因在不同孵育时间的东亚飞蝗卵中的表达情况;并通过毕赤酵母诱导表达途径对Lm-TSP进行功能研究;另外还对该基因的可变剪接体进行克隆。本课题对研究昆虫的蜕皮生理发育过程,寻找新的杀虫靶标都具有重要意义。主要研究结果如下: 1、分析了东亚飞蝗五龄幼虫到成虫不同发育时期Lm-TSP基因表达情况。该基因主要在羽化前72h、24h、16h的五龄幼虫中表达,之后表达量下降。 2、分析了东亚飞蝗五龄幼虫不同组织器官Lm-TSP基因表达情况。该基因主要在五龄幼虫躯干,头和后腿中表达,在血细胞、中肠和脂肪体中几乎不表达。 3、胚胎孵化过程涉及蜕皮,分析了不同孵育时期的东亚飞蝗卵中Lm-TSP基因表达情况。Lm-TSP基因在东亚飞蝗卵中也有表达,但表达量较低,随着孵育时间的延长表达量增加。 4、将Lm-TSP在毕赤酵母中进行表达,检测到一条约45kD的条带,为下一步的继续研究奠定了基础。 5、克隆了Lm-TSP基因的五个可变剪接体序列。分别命名为Lm-TSPA,Lm-TSPB,Lm-TSPC,Lm-TSPD,Lm-TSPE。
【学位授予单位】:重庆大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S433

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