药用植物基因组DNA提取及铁皮石斛RAPD反应体系的优化

【摘要】： 随着生命科学的不断发展,分子生物学技术在药用植物学领域日益渗透,在分子水平上检测基因多态性分子标记的中药鉴定方法得到不断的发展与应用,新方法、新技术不断涌现,其中,RAPD技术由于其操作简便、快速、省时、省力,自问世以来一直很受欢迎,并迅速在动植物药材品种鉴定、原植物的种属特异性研究、易混淆品种的鉴别、药材的道地性研究等方面都取得了很大进展。 以采自四川峨眉山的13种药用植物为材料,在传统SDS-KAc提取方法中的KAc除去变性蛋白这一步骤后,用“酚:氯仿”抽提上清2～3次,而后在核酸沉淀过程中,利用共沉淀差异,快速钩取核酸絮状物有效地除去多糖、酚类物质对核酸的污染。用该法提取的药用植物DNA质量高,经电泳检测,DNA无降解,RAPD-PCR和酶切鉴定说明该法所提的DNA能够满足后续实验的要求。 采用改良的SDS法提取铁皮石斛基因组DNA,A_(260)/A_(280)为1.8～2.0之间,经琼脂糖凝胶电泳证实其完整性较好,无降解。以此DNA为模板考察了dNTPs、MgCl_2、引物、模板浓度四种因素在单独及组合条件下对RAPD-PCR扩增结果的影响,结果表明在25μl PCR反应体系中四种因素的浓度分别为0.25 mmol/L、1.50 mmol/L、0.32μmol/L、0.40ng/μl时,所扩增出的指纹丰富,条带清晰且无拖尾现象。