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家蚕超氧化物歧化酶的分离纯化及其基因克隆

唐云明  
【摘要】: 对超氧化物歧化酶的研究,目前已有许多报道。已克隆和测序的SOD 的基因大约有100个,而且每年还将有许多SOD研究的报道。但是迄今研究 表明:至今尚未发现两个完全相同的SOD基因。作为药用S0D,在美、德等 国已有产品,但国内尚无。由于动物、植物和微生物中SOD的含量很少,分 离纯化的工艺复杂。所以利用基因工程技术高效生产SOD产品,具有重要研 究价值。如果能在蚕体高效表达SOD基因,则家蚕和养蚕业的优势,将为这 一基因工程产品创造极好的发展前景。基于此种思考,本研究首先进行了家 蚕S0D的分离统化,并对其末端进行序列分析,然后根据末端的分析结果设 计、合成引物,通过RT-PCR法扩增家蚕SOD的cDNA,并克隆获得了SOD基 因,为SOD的应用奠定了基础。现将研究结果报告于下: 1.分离纯化 通过SOD活性与同工酶调查研究,结果表明家蚕SOD是受多基因支配 的,而且有主基因控制。根据SOD活性与同工酶调查结果确定实验材料。采 集家蚕体液,置-70℃的低温冰箱保存备用。家蚕体液经过热变性后离心得 粗酶液。将粗酶液过DEAE-琼脂糖柱层析,从DEAE-琼脂糖柱层析分离得到 的SOD经Sephacryl S-200凝胶柱分离。将Sephacryl S-200凝胶过滤纯化 获得的SOD经透析、干燥后,进行等电点聚焦电泳。经活性和蛋白质染色, 切取含有SOD的胶条。通过电洗脱、透析和冷冻干燥,获得SOD纯品。纯化 的SOD经等电点聚焦电泳和SDS-PAGE均显示一条蛋白带,表明纯化的SOD 蛋白质是均一的。最后纯化倍数为1911,活性回收率为35%。 2.性质研究 Cu.Zn-SOD对氰化物和过氧化氢均敏感,Mn-SOD对氰化物和过氧化氢均 不敏感;而Fe-SOD对氰化物不敏感,对过氧化氢敏感。1mmol/L的KCN 抑制家蚕纯化的SOD活力达92%, 5mmol/L的H_2O_2完全抑制该酶的活力。原 子吸收光谱法测得每毫克SOD含铜3.98μg、锌4.02μg,可计算出每个酶 分子含2.03个铜原子、1.97锌原子。该酶有Cu.Zn-SOD的特征吸收光谱, 即该酶在紫外与可见光区的最大吸收峰分别为270n。和676n比氨基磋组成 中不含色氨酸。所有这些结果均证明该酶为Cu.Zn{。 该酶在等电点聚焦电泳中呈现一条酶蛋白质带,其等电点为7.15。己 纯化的家蚕SOD经SDS-PAGE测得其亚基分子量约为 16 000D,凝胶过滤法 测得其分子量为32 000D。采用Edmn$解法进行了N端氨基酸测序,结果 为:N’-Met-Val-Val-Lys-Ala-[’。l-Leu-yal-lie-Asn-C’。 3.RNA的分高纯化 用CSCI密度梯度离心法获得的RNA样品,稀释100倍后经分光光度计 测定,结果为:A…为1.504,A…为0.744,*h为0.010,*。。O.016, A。讪./A…为2.022。从测定结果可以看出:RNA样品的纯度较高,未被 酚或其它特殊物质污染。经计算删A的浓度为 6.of 6 u g/u L,总删A量为 1.8 mg。经删a变性琼脂糟电泳结果表明未被降解。 4.RT-PCR扩增 SOD的 CDNA 在反复试验的基础上,获得了最佳扩槽条件。即94 t变性30see,65C 沮火lMn,72℃延伸1.oin,30个循环:72℃延伸10min。以InRN反转录 的。DNA为模板,用三个引物进行两轮PCR扩增,获得了特异扩增产物。回 收扩增产物,经过Northern鉴定:以PCR扩增的特异片段制备的探针,从家 蚕脂肪体提取的RNA中检测到觎A产物。根据RNA分子量参照估算有杂交 信号的位置大约为500hP,此大小与扩增片段的大小相似,说明扩增产物来 自于家蚕的DRNA。 5.基因克隆 回收纯化的目的片段与载体连接(TA克隆)后,进行转化、涂板和Xgal 筛选。大部分为白色面落。挑取白色单菌落,于试管中培养。提取质粒DNA, 用pstlN切和PCR扩增鉴定,结果表明获得了家蚕CuZn卡 的cDNA的克 B。 6.测序与序列分析 采用双脱氧测序枯anger法人用DNA M序仪对克隆质粒进行序列测定 结果为:被克隆碱基59foP。利用DNAStar、DNAClub等软件对测序结果 2 进行分析得到以下结果:被克隆基因中N-端1~3为ATG起始密码,编码区 的459hP可翻译153个氨基酸,460~462为TAA终止密码。测出的序列具 有上下游引物,N-端含有己测序的 10个氨基酸。下游带不翻译的 111 hP, 其中包括终止密码子和末端的73个POly A”,可见是一个完整的基因。 通过cDNA翻译的家蚕CuZn-500蛋白质的分子量为:15810.20 D。l微 克等于 63.250 pmol。摩尔消光系数 (Mola Extinction coefficient)等 于1640(l)。IA(280)等于9.64 mg/mL。等电点(Isoelectric Point) 等于4.85。在pH 7电荷(Charge at pH 7)为-6.50。SOD蛋白质组成:带 电荷的氨基酸【Charged(RKHYCDE川,37个:酸性氨基酸【AcidicOE门,18 个;碱性氨基酸[Basic(KR)],11 个:极性氨基酸[Polar(NCQSTY)],36 个;疏水性氨基酸【Hyd


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