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《西南农业大学》 2001年
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小麦基因枪转化体系的建立和抗除草剂基因的导入

赵虹  
【摘要】： 小麦是重要的粮食作物之一，利用基因工程进行遗传改良的研究一直倍受人 们关注。本研究以西南地区小麦栽培品种为材料，建立起良好的再生体系和基因 枪转化体系，并把报告基因GUS和抗除草剂Bar基因导入小麦，获得了抗除草剂 Basta的转基因小麦新材料。主要结果如下： 1．基因型的选择和再生体系的建立 通过14个小麦品种的成熟胚培养，筛选出再生频率比较高、组培性状好的四 个栽培品种：川育G413、95319、绵阳19和川麦28。建立幼穗和幼胚的再生体 系：幼穗以绵阳19为主，取0.4～1.0cm长的幼穗为外植体材料诱导愈伤组织，分 化培养基MS+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L为最佳，再生率达到58.8％；幼胚培养 以川育G413和95319为主，接种时采用盾片朝上的方式，幼胚愈伤组织最佳的 分化培养基为MS+ZT0.5mg/L+NAA0.5mg/L，生根、壮苗培养基为1/2MS+IBA 5mg/L+蔗糖5％。在此条件下，幼胚愈伤再生频率达到55～75％。 2．小麦基因枪转化体系的建立 建立了小麦基因枪转化体系，并通过GUS基因的表达优化了转化条件和轰 击参数：包裹子弹的沉淀剂用50μl 2.5mol/L Ca（NO_3）_2+20μl 4O％ PEG4000， DNA/金粉的用量为0.25μg/125μg，轰击压力为1350psi，真空度27～28inches Hg， 每皿轰击一次。幼穗在轰击前预培养1d，轰击距离为9cm；幼胚在轰击前预培养 14d，轰击距离12cm；受体材料分别在轰击前4h和轰击后16h作渗透培养 （0.4mol/L渗透剂）。 3．转化体的筛选和抗性植株的获得 确定了不同筛选阶段的选择压浓度：愈伤组织继代时Basta为10～30mg/L；分化 时Basta为5mg/L或0mg/L；生根时Basta为30mg/L。按以上优化的基因枪转化 体系进行转化及筛选，最终得到了川育G413、绵阳19和Bobwhite三个品种的7 株转基因植株，转化率在0.45～1.2％之间，转化周期缩短至3个月左右。 4．转基因植株的鉴定 转基因植株经PCR检测和PCR-Southern检测证明外源Bar基因已导入小麦。 对7株转基因小麦叶片作除草剂Basta的表型性分析，结果有4株表现完全抗性， 3株表现部分抗性，表明Bar基因已在小麦植株中得到表达。
【关键词】：小麦；再生体系；基因枪；遗传转化
【学位授予单位】：西南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：S512.103.5
【目录】：
  • 中文摘要5-6
  • 英文摘要6-8
  • 第一章8
  • 一、 文献综述8-20
  • 1． 植物基因工程概述8-9
  • 2． 植物抗除草剂基因工程9-13
  • 2．1 植物抗除草剂基因工程的策略10-12
  • 2．2 抗除草剂基因工程的应用前景12-13
  • 3． 禾谷类作物遗传转化研究进展13-20
  • 3．1 禾谷类作物的组织培养13-14
  • 3．2 应用于禾谷类作物的转化方法14-16
  • 3．3 禾谷类作物转化使用的选择标记和报告基因16-19
  • 3．4 小麦遗传转化的现状、存在问题及展望19-20
  • 二、 引 言20-21
  • 第二章 小麦再生体系的优化21-33
  • 一、 材料与方法21-24
  • 1． 植物材料21
  • 2． 试验方法21-22
  • 2．1 无菌材料的获得21-22
  • 2．2 培养基22
  • 2．3 植株材料的培养条件22
  • 3． 再生体系的建立22-24
  • 3．1 成熟胚的培养22
  • 3．2 幼穗的培养22-23
  • 3．3 幼胚的培养23-24
  • 二 结果与分析24-33
  • 1． 成熟胚培养24-25
  • 2． 幼穗再生体系的建立25-27
  • 2．1 不同发育时期幼穗的培养25-26
  • 2．2 不同激素条件下幼穗愈伤组织的分化26-27
  • 3． 幼胚再生体系的建立27-33
  • 3．1 幼胚接种时最佳的放置方式27-28
  • 3．2 ABA对幼胚愈伤组织分化的影响28-29
  • 3．3 不同细胞分裂素对幼胚愈伤组织分化的影响29-30
  • 3．4 ZT与不同生长素组合对愈伤组织分化的影响30-31
  • 3．5 干燥处理对愈伤组织分化的影响31
  • 3．6 不同生长素和蔗糖浓度对生根的影响31-33
  • 三、 讨论33-36
  • 第三章 小麦的基因枪转化36-57
  • 一、 材料与方法36-45
  • 1． 材料36-38
  • 1．1 受体材料36
  • 1．2 质粒36
  • 1．3 主要仪器36
  • 1．4 主要试剂36-37
  • 1．5 常用培养基或溶液配方37-38
  • 2． 试验方法38-45
  • 2．1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化38
  • 2．2 质粒DNA的大量提取38-39
  • 2．3 质粒DNA的纯化39
  • 2．4 质粒DNA的定量39
  • 2．5 微弹制备和基因枪轰击39-40
  • 2．6 基因枪转化体系的优化40-41
  • 2．7 受体材料对除草剂Basta的敏感性试验41
  • 2．8 轰击前材料的准备和轰击后转化子的筛选41
  • 2．9 转基因植株的鉴定41-45
  • 二 结果与分析45-53
  • 1． 质粒DNA的提取、纯化和定量45
  • 2． 基因枪转化体系的优化45-49
  • 2．1 子弹包裹方式对GUS基因表达效果的影响45-46
  • 2．2 不同金粉及DNA用量对转化效果的影响46-47
  • 2．3 轰击的氦气压力对转化的影响47
  • 2．4 幼穗转化条件的优化47-48
  • 2．5 幼胚转化条件的优化48-49
  • 2．6 基因枪转化体系的确立49
  • 3． 受体材料对除草齐Basta的敏感性试验49
  • 4． 转化体的筛选和抗性植株的获得49-50
  • 5． 转化体的检测和鉴定50-53
  • 5．1 GUS基因瞬时表达的检测50-51
  • 5．2 抗性愈伤组织的PCR检测51-52
  • 5．3 转化植株叶片对除草齐Basta的抗性52
  • 5．4 转化植株的PCR检测52-53
  • 5．5 转化植株的PCR-Southern杂交53
  • 5．6 小麦转基因植株的育性表现53
  • 三、 讨论53-57
  • 附图57-60
  • 小结60-61
  • 参考文献61-68
  • 缩略词表68-69
  • 致谢69

【引证文献】
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10 葛荣朝;;小麦耐盐相关基因TaSTK的克隆与功能研究[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编（2004-2008）[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 刘洪春;怀远145万亩小麦全面开镰[N];蚌埠日报;2006年
2 通讯员 杨玉栋朱永生;泗水抓好小麦秸秆禁烧及利用[N];济宁日报;2007年
3 史润生;山西小麦去年减产较多 今年与去年一样不容乐观[N];粮油市场报;2006年
4 万达期货 李警卫;美盘利多恐慌挥之不去 郑盘徘徊之中意欲突破[N];粮油市场报;2007年
5 王伟民;我市夏收进入收官[N];苏州日报;2007年
6 高传立;我市万亩连片小麦亩产创新高[N];徐州日报;2008年
7 记者 李冬玲;河南小麦“出访”东南亚[N];中国质量报;2003年
8 ;2002我国小麦出口优势分析 有备便有商机[N];农民日报;2003年
9 课屏昕;邢台 小麦交易平淡[N];农民日报;2004年
10 农业部市场与经济信息司供稿;小麦、大米价升 玉米价降[N];农民日报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 侯文胜;优化三种遗传转化体系创造转抗虫基因小麦（Triticum aestivum）新种质[D];西北农林科技大学;2001年
2 陈新宏;大麦与小麦杂交及其杂种后代的创制、鉴定和应用研究[D];西北农林科技大学;2003年
3 马雷;稻米与小麦质量标准的中外比较研究[D];扬州大学;2005年
4 李孟军;小麦耐盐相关基因HKT克隆及多样性与功能研究[D];中国农业科学院;2006年
5 姜涛;小麦矮秆基因同源序列的克隆与BAC源合池的构建[D];中国农业科学院;2002年
6 李斯深;小麦产量性状QTL的分子标记定位[D];山东农业大学;2002年
7 苗红梅;小麦淀粉合成关键酶基因启动子的克隆与特征[D];河南农业大学;2004年
8 徐文忠;小麦春化相关基因元件克隆分析与小麦矮化突变体的研究[D];中国科学院研究生院（植物研究所）;2003年
9 戴艳;小麦组蛋白修饰酶基因及DNA甲基转移酶基因的分离及鉴定[D];中国农业大学;2005年
10 马守才;小麦多子房性状的遗传研究及AFLP分子标记[D];西北农林科技大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 赵虹;小麦基因枪转化体系的建立和抗除草剂基因的导入[D];西南农业大学;2001年
2 孙红正;基因枪法将HMW-GS（5+10）基因转入小麦的研究[D];河南农业大学;2004年
3 梁欣欣;利用DREB转录因子改良小麦耐盐性的研究[D];中国农业科学院;2004年
4 张小村;小麦抗纹枯病基因的遗传和分子标记分析[D];山东农业大学;2004年
5 彭丹辉;小麦苗期热胁迫基因表达谱分析及相关基因的克隆[D];中国农业大学;2005年
6 朱永飞;小麦T型细胞质雄性不育育性恢复基因的SSR标记定位[D];中国农业大学;2005年
7 许景升;小麦外源抗黄矮病基因相关片段的克隆和鉴定[D];河北师范大学;2003年
8 周章乐;小麦抗白粉病相关基因片段的筛选、克隆及序列分析[D];天津师范大学;2003年
9 刘丽;小麦叶片硝酸还原酶活性调控机制研究[D];山东农业大学;2005年
10 张新军;冬小麦不同密度下两品种混合群体效应的研究[D];河北农业大学;2007年
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