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《西南农业大学》 2002年
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豌豆种子铁蛋白的纯化及其抗血清的制备

袁小红  
【摘要】: 铁与人类的营养和健康息息相关,缺铁会引起贫血、发育不良、免疫机制受损、神经失态等疾病。植物是人类营养的主要来源之一,但由于植物性食品铁含量低且存在不易被人体吸收等问题,使得人类铁营养主要依赖于动物性食品。因此,在以谷物类等植物性食物为主要食物来源的人们中,尤其在发展中国家和地区,存在严重的缺铁问题。铁蛋白(Ferritin)是广泛存在于动物、植物和微生物中的一种由24个亚基组成的贮铁关键蛋白质,其贮存的铁具有可溶、无毒和生物可给性等特点。已有的研究表明,使用孟德尔遗传方法和生物技术途径提高大豆和其它谷物类种子中铁蛋白的表达和其它可溶性铁成分,将有助于全球性缺铁问题的有效解决。 利用免疫检测技术进行植物转基因的表达检测是一种简单、灵敏、快速、可靠的方法,但其前提条件是要有与转基因植物目的基因表达的蛋白质发生特异性免疫反应的抗体或抗血清。根据植物铁蛋白之间有高度同源性和交叉免疫反应的特性,利用特异性的豌豆铁蛋白抗血清,就可通过免疫沉淀、ELISA或Western杂交等免疫检测方法进行植物铁蛋白含量等的检测,从而更好地进行转基因方面的研究。本论文开展了豌豆铁蛋白的纯化、免疫家兔制备豌豆铁蛋白抗血清以及植物铁蛋白免疫学检测等一系列的研究,现将主要研究内容和结果总结如下: 1、铁蛋白检测系统的建立 纯化过程中以邻菲咯啉显色法检测铁蛋白,具有简单、灵敏、直观等优点。在酶标板小孔中加入30μl待测液,加入30μl20%的连二亚硫酸钠溶液还原后,再加入40μl0.1%邻菲咯啉溶液,根据有无桔红色颜色产生确定是否含铁蛋白。还可用酶标仪测定该混合液510nm吸光值来进行定量分析。 2、豌豆种子铁蛋白的纯化 豌豆种子经浸泡、匀浆、过滤、离心等操作得到豌豆铁蛋白粗提液,再用终浓度为50mmol/L的MgCl_2盐析等处理后,经AcA_(22)凝胶过滤柱层析和DEAE-纤维素52(DE52)阴离子交换柱层析等方法进行纯化,得到单一的豌豆铁蛋白洗脱峰。通过上述操作,豌豆铁蛋白的产率为20-30mg/kg。 3、纯化的豌豆铁蛋白的纯度鉴定 经AcA_(22)凝胶过滤柱层析和DEAE-纤维素52阴离子交换柱层析等方法纯化的豌豆铁蛋白在非变性条件下进行PAGE电泳,银染后显示为一条带,表明通过该方法即可获得电泳纯的豌豆铁蛋白,它可以作为抗原制备特异性较高的豌豆铁蛋白抗血清。SDS-PAGE显示该蛋白仅含28kD—条亚基,表明纯化得到的豌豆铁蛋白具有完整的亚基。 4、免疫家兔制备豌豆铁蛋白抗血清 民二功寻咬径B一 仑 一 以纯化的豌豆铁蛋白作为抗原,并分别加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐 剂等兔疫家兔,经过足掌、背部皮下、腹腔和耳静脉等途径进行免疫,7周后 获得效价高达 1:32以上的豌豆铁蛋白抗血清。(NH)SO。分级盐析法纯化后的 抗体效价保持二:16。这表明通过上述方法制备的豌豆铁蛋白抗血清具有较高 的效价。 5、植物铁蛋白的免疫学检测 琼脂糖免疫双相扩散法显示,制备的豌豆铁蛋白抗血清可与大豆铁蛋白粗 提物发生免疫交叉反应。这表明己经获得了具有较高特异性的抗血清,可以用 于植物铁蛋白的含量测定和转基因植株的表达检测等研究。
【学位授予单位】:西南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q946

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