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《西南农业大学》 2002年
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根癌农杆菌介导的甜樱桃茎尖遗传转化体系的建立

沈烨  
【摘要】: 木本植物包括大部分果树以及所有的林木,在国民经济和人类生存方面发挥着极其重要的作用。木本植物相对于大田作物和其他草本植物有一个较长的营养生长期,这是运用传统杂交育种方法改良木本植物性状的主要障碍。植物遗传转化为克服木本植物传统育种局限性、加速树木遗传育种进程提供了一条有效途径。植物遗传转化能在分子水平上改造植物的遗传物质,它可以打破物种之间的生殖隔离障碍,定向改造植物遗传性状,提高了育种的目的性和可操作性。 植物遗传转化的研究和应用在近二十年中取得了巨大的发展,但是木本植物的遗传转化却远远落后于大田作物和其他草本植物。主要原因是木本植物的高频再生体系和高效遗传转化体系不够完善。绝大部分果树属于木本植物。果树的遗传转化进展缓慢,甚至落后于林木,其原因仍然是缺乏适宜的遗传转化受体和高效的遗传转化方法。 樱桃是一年中最早上市的水果(木本),填补了春淡水果市场,而且风味和色泽深受人们喜爱。但其具有果小、核大、肉薄和裂果的缺点,而且是传统育种方法很难改良的树种之一,这促使人们想通过遗传转化技术改变其不良性状。但缺乏合适的高效转化体系,为建立木本果树优良的遗传转化体系,本论文以甜樱桃为材料,用甜樱桃茎尖作外植体,建立了甜樱桃茎尖高频再生体系;并以驯化培养后的甜樱桃茎尖为受体,通过优化农杆菌遗传转化方法的各项参数,建立了甜樱桃茎尖遗传转化体系,其结果如下: 1、确定甜樱桃芽的再生体系 通过进行不同激素组合对甜樱桃腋芽分化率的影响实验,确定了甜樱桃芽的再生体系为:诱导甜樱桃芽分化的培养基是B_5+1.0mg/L BA+0.1mg/LNAA、B_5+1.0mg/L BA+0.2~0.5mg/LIAA,增殖培养基是B_5+BA0.25mg/L+NAA0.05mg/L,生根培养基是B_5+IBA0.2~0.5mg/L。甜樱桃芽在该再生体系中的再生频率为97%。 2、比较不同浓度Cef的杀菌效果和受体材料对Kan的敏感度,确定了Cef的脱菌浓度是500mg/L和Kan的筛选强度50mg/L。 3、建立了农杆菌介导的甜樱桃茎尖转化体系 棍癌农杆菌介导的甜樱状茎尖迟传转化体系的灭立 用驯化培养的甜樱桃茎尖作受体,优化了农杆菌介导转化体系的多项参数; 以OD。。0二~0.5的农杆菌菌液感染30删后共培养3d,能获得0.78%的抗性绿芽 率。 4、通过比较二即筛选、延迟筛选和梯度筛选三种筛选方式对抗性绿苗率的影 啊,得到梯度筛选的转化率为0.85%,是该转化体系的较好筛选方式c 5、实验研究了AS、Tween20和负压等回素对转化效率的影响,表明AS可明显 提高转化效率,其最适浓度为120fnmoll;T、cen20和负压处理也能提高转化频 率,了、een20的适宜浓度是 0.l%,负压的适宜处理是 lmm XIO次。 6、通过P*R扩增,初步证明证明外源基回己转入甜樱桃。
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