外源基因在家蚕中靶向整合及线粒体载体研究

【摘要】： 家蚕是蛋白质高效转化生物，具有周期短、繁殖率高、后代个体数多、能大量饲养等优点。蚕丝业在我国已有五千多年历史，家蚕作为一种模式生物，其基础研究和分子生物学研究取得了巨大进展，开展其转基因研究的基础条件正日趋成熟。家蚕转基因研究在基础理论研究、特异品种培育和生物工程制药上，都具有巨大的潜力和实际意义：在基础理论研究方面，由于外源基因在宿主中能进行复制整合与表达，并受制于受体基因组遗传背景的调控，因此转基因本身成为一个理想的功能标记，在基因表达调控机理研究方面颇有价值，如近来时空特异性顺式调控元件及其远程作用力、反式作用因子及其相互作用、基因协同表达、复合型启动子/增强子外源基因的反馈调节以及染色体内重组等一系列重要发现就得益于转基因模型；在品种改良方面，可改良家蚕的某些性状，如抗病性、性别控制、改进蚕丝的品质和加工性状等；在生物反应器开发方面，还可利用转基因家蚕生产工程蛋白及高附加值产品，如人抗血友病因子、白细胞介素等。 但遗憾的是家蚕不能象哺乳动物那样，可通过受精卵显微注射—细胞培养—受精卵移植—发育成成熟个体的途径制作转基因个体，而只能通过将外源基因导入蚕卵的方式来实现。但蚕卵卵壳坚硬，卵黄丰富，外源基因难以穿透坚硬的卵壳进入细胞核；并且目前的整合载体不够理想，外源基因即使转移到家蚕受精卵中，也很难稳定整合到家蚕基因组中，这两点限制了家蚕转基因研究的发展。 本论文针对这两个问题，以精子介导法利用同源重组技术对家蚕丝素重链基因进行基因打靶，探讨了精子介导法导入外源基因的优越性、外源基因在宿主细胞中的滞留与整合、同源重组发生的动态过程，以及用线粒体DNA作家蚕转基因载体的可行性等。现将主要研究内容和结果总结如下： 1．引导同源重组的同源臂池的构建 为了探索一条更为有效的整合策略，使外源基因能定点整合到靶位点，又不破坏宿主基因的启动子、内含子等表达调控元件，令外源基因对宿主生理功能的影响达到最小，我们以丝素重链基因2号外显子为整合靶位点，以便将外源基因定点整合其间，为此，需要在其两端接上与丝素基因同源的DNA片段，以引导同源重组的发生。分析丝素重链基因2号外显子结构，发现其由12个结晶区与11个不定型区相间排列而成，于是扩增其结晶区作同源臂。但由于结晶区GC含量高，序列内部重复性高，二级结构复杂，常规PCR无法扩增出目的产物。本研究通过调整反应体系缓冲液pH值、采用高保真pfu DNA聚合酶和Klenow酶组合、加缓解二级结构的有机试剂甲胺、换引物多步扩增而成功实现了重复区片段R02-R11的扩增。将扩增产物克隆进pUC19质粒载体中，就构建成同源臂 ＄S 池。这为高GC含量、高重复性模板、较长靶序列复杂PCR扩增提供了可借鉴之路。 将Tris叫 缓冲液的幽提高到8．8刁．2u5℃），以补偿因温度增高带来的 l讥下降， 而避免脱瞟吟事件的发生，才能保证长序列PCR的顺利进行。 高GC含量使模板二级结构复杂而稳定，一般热启动难于解开，而变性温度过高、时 间过长又不利于DNA聚合酶的活性作用发挥，于是借助能缓释模板二级结构的有机试剂 甲胺扩增高GC含量模板。 ／u0M聚合酶比T叫酶有更高的保真复制性能和热稳定性，更有利于高（儿含量模 板的扩增。PCR热循环完成后，加入具有3’6’核酸外切酶活性的Klenow片段温育， 能切除误配碱基，而降低多步扩增中碱基误配级联扩增的错误。 2．槽子介导法向家蚕导人外源基因 先将外源目的GFP基因克隆到质粒PUC19的多克隆位点，再将克隆的结晶区序列R05 和m 分别引入到GFP的两端，得到以绿色荧光蛋白为报告基因的同源打靶质粒［，GFPLR。 将打靶质粒酶切线性化后，分别注入到雌蛾交配囊和雄蛾贮精囊，－与正常蛾交配产卵， 分析外源基因在当代的情况。实验结果，精子介导法制作转基因蚕的阳性率约为20－40％， 说明该方法是可行的。但分析结果同时表明，外源0＊A在受精卵中是不均匀分0泊0，同 一蛾区也存在嵌合现象，有些个体是转基因蚕，有些则不是，这就增加了转基1）．］蚕筛选 和继代的难度。将外源DNA‘注射进雄蛾贮精囊比注射到雌蛾交配囊后代有更’，：j的阳性 率，且同蛾区嵌合现象轻些。 3．外槽基因在宿主细胞中的滞留与鳖合 为了探索转基因的分子生物学特性，本研究探讨了外源基因在宿主细胞中的滞留和 整合情况，发现外源基因随精子进入家蚕受精卵后，在整合前有一个滞留期，／l｛该时期 发生一系列染色体外重组、修饰事件：注入的外源0＊A分子末端发生蚕食，随行一部分 分产发生分子间连接产生线状多联体，其游离端是重组的优选位置。一部分分J，产生分 子内连接，头尾相连成环状。环状多联体在不断参与连接过程中再开裂成线状，开裂位 置是随机?

【学位授予单位】：西南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：S882