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《西南农业大学》 2003年
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昆虫病原真菌降解寄主体壁酶基因的克隆及球孢白僵菌高毒力重组菌株的获得

方卫国  
【摘要】: 随着大面积使用化学农药所造成的环境污染和农药残留等问题日益突出,以生物防治为主的害虫防治策略正受到广泛重视。在众多的杀虫微生物中,由于昆虫病原真菌具有主动感染寄主、能形成循环侵染和寄主难以产生抗性等优点,因此目前正得到越来越多的关注。但是,昆虫病原真菌存在击倒害虫时间长和防效不稳定等缺点,这限制了它们的进一步应用。为了改变这一局面,有必要加强昆虫病原真菌致病分子机理的研究,为利用基因工程技术改良菌株奠定理论基础和提供目的基因。穿透体壁是在昆虫病原真菌感染寄主的过程中重要的步骤之一。昆虫体壁主要由蛋白质和几丁质组成,昆虫病原真菌则通过机械压力和蛋白酶、几丁质酶等水解酶的作用降解昆虫体壁。已有研究表明,类枯草杆菌蛋白酶在金龟子绿僵菌致病寄主的过程中起重要作用,而几丁质酶所起作用较小。本文首先研究类枯草杆菌蛋白酶在球孢白僵菌致病过程中的作用,然后从蛋白酶和几丁质酶相互作用的角度来研究几丁质酶在球孢白僵菌感染昆虫过程中的作用,并在此基础上获得球孢白僵菌高毒力菌株。主要研究结果如下: 1.球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1及其上游调控序列的克隆与分析 蛋白质是昆虫体壁的主要组成成份,降解昆虫体壁蛋白的类枯草杆菌蛋白酶Pr1被证明是金龟子绿僵菌的重要致病因子,为了研究Pr1类蛋白酶在球孢白僵菌感染寄主过程中的作用,我们首先从该病原真菌中克隆Pr1类蛋白酶基因。 从在蝉蜕诱导培养基内培养的球孢白僵菌芽管状物中提取总RNA,并用于构建诱导cDNA文库。完整cDNA文库的滴度为3.1×10~4 pfu/μl,外源片段的长度集中在0.7kb到1.6kb之间。以Pr1类蛋白酶基因的部分DNA序列BbP为探针从该cDNA文库中筛选到球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的全长cDNA。该cDNA长为1557bp,含有1134bp的开放阅读框,编码一377个氨基酸的蛋白酶前体,其氮端18个氨基酸为信号肽序列。CDEP-1对应的基因组序列为gCDEP-1(Genebank登录号为AY040532),其中有3个内含子。Southern杂交分析表明,gCDEP-1在球孢白僵菌基因组上为单拷贝。CEDP-1推导的氨基酸序列与金龟子绿僵菌的MaPr1、白色念珠菌的蛋白酶K和球孢白僵菌的BbPr1的相似性分别为54.7%、57.9%和83.3%。CDEP-1推导的氨基酸序列氮端327个氨基酸和BbPr1的几乎完全相同,其后CDEP-1有50个氨基酸,BbPr1则只有33个,而且二者差异很大。因此,CDEP-1为Pr1类蛋白酶基因的新成员。 在蝉蜕诱导培养基中,加入葡萄糖能阻遏CDEP-1的表达,加入丙氨酸则只能部分阻遏CDEP-1的表达。为了进一步研究CDEP-1的表达规律,利用YADE 中 文摘要 技术克隆它的上游调控序列。YADE法扩增出了 CDEP*上游长为 1705hp的调 控序列CDEPP。序列分析发现,CDEPP中含有多个葡萄糖阻遏于的结合位点(共 同序列为 5卜(g/C)YggRg<3‘人和氮阻遏子的结合位点(相隔很近的DNA序列 “ GATA”)。 L球抱白僵菌内切几了质酶*bCMd的纯化及其基因的克隆与分析 几丁质占昆虫体壁17-50%,在抵御外来做生物入侵时起重要作用。在感染 昆虫的过程中,昆虫病原真菌分泌多种几丁质酶,但是有关几了质酶在病原真菌 致病寄主过程中所起作用的研究很少。到目前为止,还未有从球抱白僵菌中克隆 几了质酶基因的报道。为研究几丁质酶在球抱白僵菌感染寄主过程中的作用,我 们从该病原真菌中纯化几丁质酶,并克隆其相应的基因。 2.二 内切几丁质酶*bCMd的纯化及氮端序列测定 从球抱白僵菌在胶体几丁质诱导培养基内培养了168h的诱导液中,利用硫 酸氨沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析纯化出了内切几了质酶 BbChit。 Bbchitl的分子量为33kDa,等电点为5石万 氮端22个氨基酸为Ala七ly1hr- Cys-Ala-Thl-Lys-GlyATg-Pro-Ala-Gly-Lys-ValLeu-Gin-G卜Tyr-Tp-Gin-Asn-Tp。 2.二球抱自僵菌内切几丁质酶基因BbChitl的克隆 根据内切几丁质酶Bbchitl的氮端氨基酸序列设计简并引物,采用3‘RACE 和 YADE技术获得了 BbChitl的基因和该基因的部分上游调控序列,该基因命名 为Bbchitl(Genbank登录号为AY145440)。Bbchitl含有长为1047hp 的开放阅 读框架,编码一348个氨基酸的几丁质酶前体,其中N端28个氨基酸为信号肽 序列。Bbchitl 的基因组序列不含内含子,在球施白僵菌的基因组上为单拷贝。 在BbChitl 的上游调控序列中有7个葡萄糖阻遏子结合位点(共同序列为 5”叶g/C)YggRg《”人这与BbChitl的表达受葡萄糖阻遏的结果一致。在推导的氨 基酸序列中含有几丁质酶典型的保守区域 SXGG和 DGIDXDXE。有趣的是, Bbchitl推导的氨基酸序列与其它来自昆虫病原真菌的几丁质酶基因的相似性很 低。BbChitl与金龟子绿僵菌的几了质酶基因CHITZ、CHIZ、CHI]j和黄绿绿 僵菌的几丁质酶基因 CHH的相似性分别为 20%,ZI%上3%和 25%。表明,BbChitl 是从昆虫病原真菌中克隆的一新几了质酶基因。 3.球抱白僵菌几丁质酶基因BbChitZ的克隆与分析 在昆虫病原真菌感染寄主的过程?
【学位授予单位】:西南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S476.1

【引证文献】
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【参考文献】
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9 张希太;;高粱DNA导入小麦“矮早8”引起后代变异的研究及SSR分析[J];安徽农学通报(上半月刊);2011年05期
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7 尹钧;任江萍;李志岗;李磊;周苏玫;卫丽;宋丽;;转基因抗穗发芽小麦的获得[A];中国作物学会2007年全国作物遗传育种学术研讨会论文集[C];2007年
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9 杨莉;徐昌杰;陈昆松;;金柑遗传体系的建立及应用[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
10 齐靖;申连英;毛永民;曹柳青;兰海波;陈亮;;枣转基因研究前景展望[A];第五届全国干果生产、科研进展学术研讨会论文集[C];2007年
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4 冯守千;红梨着色机理的研究[D];山东农业大学;2011年
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7 郝金凤;无载体无选择标记转基因耐贮藏甜瓜的培育[D];内蒙古大学;2010年
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10 陈美元;双孢蘑菇基质降解能力退化分子机理的初步研究[D];福建农林大学;2011年
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1 张庆福;枳精氨酸脱羧酶基因(PtADC)转化烟草提高抗脱水研究[D];华中农业大学;2010年
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9 刘无双;拟南芥种子特异表达基因启动子分析[D];山东农业大学;2010年
10 于军伟;苹果α-法尼烯合成酶基因转化番茄研究[D];山东农业大学;2010年
【同被引文献】
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3 康曼;;球孢白僵菌分子生物学研究进展[J];广东农业科学;2011年24期
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10 边强;王广君;张泽华;高松;农向群;;基因工程改良在昆虫病原真菌中的应用[J];中国生物工程杂志;2009年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 梁宗琦;;昆虫病原真菌的综合开发研究[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第一卷)[C];1986年
2 牟甲佑;肖慕能;李筱英;蒋三俊;;药用昆虫病原真菌的开发利用[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第二卷)[C];1991年
3 刘杏忠;;昆虫病原真菌研究现状、问题及展望[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第五卷)[C];2003年
4 邓春生;吴正铠;叶正楚;;昆虫病原真菌的致病力[A];全国生物防治学术讨论会论文集[C];1991年
5 陈祝安;;昆虫病原真菌双生座壳孢的流行特点及其应用研究[A];《中国虫生真菌研究与应用》(第一卷)[C];1986年
6 王小欣;;一株杀虫真菌的分离和特性研究[A];2009’环保农药新技术、新产品暨生物农药技术研讨会论文集[C];2009年
7 李国霞;宋肖玲;周夏娣;;两种昆虫病原真菌杀虫活性物质的提取纯化与生物测定[A];新世纪(首届)全国绿色环保农药技术论坛暨产品展示会论文集[C];2002年
8 邱君志;马慧斐;陈宇熹;;座壳孢属真菌的分类研究[A];第二届菌物教学科研研讨会论文集[C];2006年
9 刘晓燕;吕利华;何余容;冯夏;陈焕瑜;;几种昆虫病原真菌对红火蚁的致病力初步研究[A];科技创新与绿色植保——中国植物保护学会2006学术年会论文集[C];2006年
10 邱振兴;张冬冬;邱君志;;昆虫病原真菌高产几丁质酶菌株的筛选[A];2008年福建省科协第八届学术年会农业分会场论文集[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 记者 高燕;自治区植保站推广使用两种生物制剂[N];新疆科技报(汉);2009年
2 州农业技术推广总站植保科供稿;农作物病虫害绿色防控技术(二)[N];伊犁日报(汉);2009年
3 记者 王菲;球孢白僵菌“降伏”马铃薯甲虫[N];新疆科技报(汉);2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 栾丰刚;引起昆虫自然流行病的昆虫病原真菌种群遗传结构研究[D];安徽农业大学;2011年
2 方卫国;昆虫病原真菌降解寄主体壁酶基因的克隆及球孢白僵菌高毒力重组菌株的获得[D];西南农业大学;2003年
3 韩燕峰;中国拟青霉属的系统学及部分菌株的致病性研究[D];贵州大学;2007年
4 汤强;玫烟色棒束孢毒力基因的克隆与表达及球孢白僵菌高毒力重组菌株的获得[D];安徽农业大学;2009年
5 李钧;金龟子绿僵菌耐夏季高温能力的种内变异、一新孢壁蛋白的基因克隆及功能鉴定[D];浙江大学;2009年
6 宋婷婷;害虫生防真菌多药抗性与侵染褐飞虱的高毒力菌株筛选策略研究[D];浙江大学;2011年
7 秦毅;表达苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aal的球孢白僵菌工程菌株的构建及其对斜纹夜蛾幼虫的肠道与体壁侵染力[D];浙江大学;2010年
8 谢雪钦;球孢白僵菌超氧化物岐化酶(SODs)的基因克隆、鉴定及功能分析[D];浙江大学;2010年
9 张蕾;转基因金龟子绿僵菌获得的口服毒力评价与自噬基因ATG5对球孢白僵菌生防潜能的贡献[D];浙江大学;2013年
10 农向群;绿僵菌与宿主蛴螬田间互作及种群续存研究[D];中国农业科学院;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 马维思;昆虫病原真菌分离鉴定及其对两种药材害虫防治潜力评价[D];北京协和医学院;2012年
2 王品;我国茶园土壤昆虫病原真菌物种多样性与群落结构研究[D];安徽农业大学;2013年
3 任巧云;对硬蜱高致病性虫生真菌菌株的分离、鉴定与筛选[D];中国农业科学院;2013年
4 涂增;莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)cq菌株(Nr-cq0310)的研究[D];西南大学;2006年
5 翟逸;莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)产几丁质酶条件及酶活性研究[D];西南大学;2008年
6 吴迪;钙调磷酸酶对球孢白僵菌生物学特性影响[D];西南大学;2008年
7 郭书娟;利用家蚕几丁质酶Bmchi提高球孢白僵菌的毒力[D];西南大学;2007年
8 朱炎平;蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)几丁质酶基因Aachit的研究[D];福建农林大学;2007年
9 冯静;几丁酶—蛋白酶融合基因的构建与球孢白僵菌毒力的提高[D];西南大学;2006年
10 陈宜涛;玫烟色拟青霉双相发酵工艺及分生孢子粉贮存生理研究[D];浙江大学;2002年
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