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《西南农业大学》 2003年 博士论文
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根癌农杆菌介导SAG_(12)-ipt和3DN-iaaL基因转化切花菊及抗早衰研究

郑丽  
【摘要】: 上世纪九十年代中期至今,切花菊产销量占全球切花总量的60%以上,国内外市场的需求量与日剧增,其在世界范围内的周年供应及流通具有十分重要的意义。美国加洲大学采后技术专家A.K.Kader指出,园艺作物采后损失的数量,发达国家为5%-25%,发展中国家为20%-50%,因此切花菊采后品质的保持及其抗衰老的研究作为其流通环节的重要技术保障也受到广泛重视。切花菊采后主要问题是花、叶干萎,叶褪色或黄化,花朵不开及瓶插寿命缩短等,叶片早衰现象的发生则是影响切花菊品质的首要问题。目前切花保鲜技术传统的方法多是通过施加外源激素来改变切花体内植物激素的水平,从而达到延缓切花衰老的目的。郭维明等通过外施6-BA的方式,有效地维持了切花菊良好的水分状况并促进了叶绿素、可溶性蛋白质的合成、明显提高了切花菊的品质和寿命,但仍不能从根本上解决切花菊叶片的早衰现象。所以在提高切花自身遗传品质的基础上,再结合采后技术以保障切花采后品质是解决流通环节切花采后损失的根本措施。国内外鲜切花研究进展显示,有关提高切花采后性状的研究多集中于传统方法选育、引种驯化及栽培管理等方面,利用生物工程改善切花采后性状的研究与国际国内市场对切花品质要求的日益提高相比,却显得十分薄弱。传统育种方法选育切花菊优良品种,存在随意性大、杂交难度大、稳定性差、周期太长等问题;而通过基因转化的方法对切花菊品种加以改良,使切花菊获得抗衰老的生物学特性,正在于具有打破遗传障碍、实现优良目的基因的定向转移、后代易于稳定、周期较短等优势。因此,采用基因工程手段,利用异源基因来创造抗衰老的切花菊新材料是合理而必要的。 郭维明等研究发现,衰老期切花菊叶片内源ABA及IAA增加可能是诱导叶片乙烯生成导致叶片早萎的原因,ABA处理后菊花叶片乙烯增加8倍,经ABA、6-BA顺序处理后,乙烯生成全被拮抗,体内较高水平的CTK可延缓切花菊衰老。利用基因工程向切花菊中导入抑制衰老的SAG_(12)-ipt自动调控元件有望解决切花菊早衰问题。该自动调控元件由衰老诱导的SAG_(12)启动子控制,可在衰老启动时特异性地使细胞分裂素短时过量表达,从而达到延缓叶片衰老的目的。Gan等人将该元件转入烟草,导致转基因烟草植株的叶片衰老和光合功能衰退都减缓,且不发生叶片发育异常现象。 游离态IAA是ETH生成的诱导因子,它可通过对ACC合成酶活性的提高以促进乙烯生成的途径参与衰老调节。Saradhi发现,IAA可逆转CoCl_2对切花菊的延衰作用,BA的作用一定程度上也会被IAA拮抗。吲哚乙酰胺赖氨酸酯合成酶基因(iaaL基因)是一个来源于橄榄瘤肿病原菌丁香假单孢杆菌 一 西南农业大学博士学位论文 很癌农杆菌介导SAG;。、iPt和3DN-laaL基因转化切花菊及抗早衰研究 (Pseudomonas.Sy…e subspsalatstalloi)的编码阿跺乙酸胺赖氨酸酯合成酶的 基因,该基因编码的产物催化游离的IAA与赖氨酸生成IAA-lysine复合物而使 IAA失去其生物活性。Romano和Spena等将355一aaL基因导入烟草和马铃薯, 该基因组成型表达使转化植株游离IAA含量大幅度下降,从而使顶端优势减弱。 本研究旨在通过根癌农杆菌介导的方法,将SAG12-… 自动调控元件及 3DN.laaL基因分别导入切花菊‘黄秀芳’,以期获得延缓叶片早衰的切花菊新材 料;并通过基因工程研究方法进一步从分子水平探讨切花菊衰老过程中的激素调 节机理。 主要工作和结果如下: 1.切花菊‘黄秀芳’高频再生体系的研究 通过对三个切花菊品种4种外植体再生体系的研究,获得了适合于切花菊 ‘黄秀芳’以幼嫩叶片、花瓣为外植体的高频再生体系,其再生频率分别高达 90%和95.6%。选择了以幼嫩叶片为外植体的体系作为切花菊‘黄秀芳’的转基 因遗传操作体系。 2.切花菊‘黄秀芳’转化体系的建立 根据感染时间和感染方法、共培养时间和外植体的脱菌、Xill选择压的确定、 延迟筛选时间等因素与转化频率的相关性研究,建立了适合于切花菊‘黄秀芳’ 的根癌农杆菌介导的转化体系即:叶盘菌液超声波侵染IO分钟或摇床20_h: 黑暗共培养60h:延迟筛选3七d;以20wtKIll为叶盘分化的抗性筛选浓度, 以15m gbh lOll为再生芽生长的抗性筛选浓度,而以10m gbhKm为生根抗性筛选 浓度连续筛选6司个月。切花菊‘黄秀芳’在该体系中对SAG12-ipt基因的转化 频率为3.1%。 3.根癌农杆菌介导的SAGl。·则基因对切花菊‘黄秀芳’转 化及其表达研究 转SAGIZ-…基因的切花菊‘黄秀芳’在株型、花芽分化、衰老期叶片持绿 期等田间性状上表现较对照不同的差异。转基因植株平均株高为对照的57%;花 芽分化期、盛花期和衰老期叶绿素?


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