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《西南农业大学》 2003年
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弹性蛋白酶优良菌种选育及酶功能特性研究

李洪军  
【摘要】: 弹性蛋白酶是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的广谱水解内肽酶,也属一种丝氨酸蛋白酶。弹性蛋白酶可影响人的脂质代谢、降低胆固醇、抑制动脉硬化发展;抑制实验性肝纤维化、脂肪肝及增强肝中脂肪分解;具有降血压耐缺氧和保护心肌作用;此外还可抑制糖尿病等。同时,弹性蛋白酶可作为产品的原料,用以制造抑制衰老的高级化妆品。在食品工业中,弹性蛋白酶具有良好的肉类嫩化作用,可研制出新的肉类嫩化酶制剂,通过处理难以食用的韧带、筋键等蛋白原料,开发出营养食品和功能食品,丰富人类食物资源,大力提高农副产品的附加值。研究表明,弹性蛋白酶在医药、食品、日用化工等方面具有较高的应用价值。因此,弹性蛋白酶是一种应用广泛的功能性蛋白酶,其市场前景十分广阔。目前,国内外大多利用胰脏来提取生产弹性蛋白酶,生产成本较高,产量十分有限,大大限制了该酶的应用范围。由于受胰脏资源的限制,产品价格十分昂贵,因此我国弹性蛋白酶大多只能用于医药上,在食品工业中的应用尚处于研究阶段。本研究从弹性蛋白酶产生菌种的选育入手,经过大量的菌种筛选,从动物副产物牛肚中筛选出了46种菌种,并从其中分离选育了1株弹性蛋白酶产生菌,系统地研究了菌种形态学特征和生理生化性能,同时,研究了菌株的产酶特性,优化了培养条件和发酵工艺,确定了变温发酵参数与条件。应用柱层析和凝胶电泳分离纯化了微生物弹性蛋白酶,研究了弹性蛋白酶的酶学性质与酶促反应动力学,确定了酶的催化动力学模型,并探讨了弹性蛋白酶对各种肉类的降解作用及嫩化效果,比较了弹性蛋白酶与现有蛋白酶的作用特点,并探讨了酶解动力学特点。 1.应用微生物菌种分离筛选与复合诱变技术,在25种动物副产品牛肚(牛瓣胃)中分离筛选得到了生长速度快,产弹性蛋白酶稳定,且酶活力较高的菌株。系统地研究了菌株的形态学特征、生长特性及其生理生化性质,研究结果表明,该菌为红色的革兰 中 文 摘 要 氏阴性杆菌,在显微镜下观察,该菌体中等大小,菌体长为2.53urn,宽为0石4urn,两 端钝园,无芽抱,单个排列无规律;在蛋白陈培养基上生长良好,菌落黄色,圆形,凸 起;在弹性蛋白平板上生长形成明显的蛋白水解透明圈。在不同温度条件下,其生长情 况显著不同,该菌在37OC-40C生长较好,培养时间相对较短,一般为18-24h。应用活 菌暗视野观察,发现该菌有微弱的运动性,可见直线运动,但距离不远。弹性蛋白酶产 生菌严格好氧,化能异养,过氧化氢酶和氧化酶均为阳性,在37oC培养能产生色素, 色素在中性和碱性培养基上呈墨绿色,在酸性培养基上呈红色;不水解淀粉;能液化明 胶;不产生脓青素。 经鉴定该菌株为假单胞杆菌(PseudomonasspSlfYI人通过利用紫外线(UV*2537 X 10””m,30Cm处,辐照 605X氯化理和 EMS复合诱变,获得了一株突变菌株 (Pseudomonas Sp S…人其产酶水平较野生出发菌株提高了 35.49%。研究表明有机 氮源有利于弹性蛋白酶的产生,其作用比无机氮源好干酪素、酵母浸膏、胰蛋自晚是 较理想的氮源,其中,干酪素不仅能促进产酶提高,而且对发酵液的pH影响较小,因 此,选择干酪素作为最佳氮源。同时,利用蔗糖、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、木糖等 复合碳源对产酶具有明显的促进作用,其中,葡萄糖能够促进菌体生物量的积累,但量 大对弹性蛋白酶的产生存在一定的阻遏作用。在发酵基础培养基中以各种不同无机盐试 验,摇瓶培养,结果表明,磷酸氢二盐对产酶有促进作用,同时也利于菌体的生长,尤 以磷酸氢一销的效果最好。而Znh、Ca》在发酵过程中对酶的产量没有促进作用。在 250mL的三角烧瓶中,摇瓶发酵培养,通过调节回旋式摇床的转速,结果表明,增大溶 氧量能促进菌体生长及酶的产生。 L采用h *5)正交试验优化假单胞杆菌(Pseudomonas Sp SWUM)生长培养基, 经方差分析表明,影响弹性蛋白酶产生的显著因素由强到弱的排列顺序为葡萄糖。 Na。HPO。、蔗糖、干酪素、pH,发酵培养基组成最佳配方为:葡萄糖0.5%,蔗糖3%, 干酪素3%,NazHPO。0.4%,酵母膏1%,0刀1%MgSO广7H。O。应用优化的培养基进行 发酵动力学研究,结果表明,选择起始 pH为 7,最适发酵温度为 37oC,250ml三角烧 一2一 弹性蛋白酶忧良菌种选育及酸功能特性研究 瓶装液量为20ml,接种量3%、种龄为12 ’J’时的种子培养液,变温发酵24h,弹性蛋 白酶的产量达到最高,其酶活性为32.3U/mL。在发酵过程中补加碳源、氮源、分段变 温培养有利于弹性蛋白酶的产生。在发酵液中按 0刀 1%(W/叫的量添加氨基酸和维生素 等生长回于进行产酶发酵试验,结果发现,氨基酸和维生素对Pseudomonas Sp SWUM 菌种的产酶有重要作用,其中精氨酸、酪氨酸和维生素C作用明显。同时发现,诱导 物能激活菌体的产酶机制,弹性蛋白能够诱导弹性蛋白酶的产生,当其诱导浓度在 0%-0石%时呈现线性关系。菌体细胞
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