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《西南农业大学》 2003年
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农杆菌介导棉花胚性愈伤转化体系的建立及转AFP-SPCEMA基因棉花的获得

鲁秀敏  
【摘要】: 棉花是世界上最重要的经济作物,其遗传改良工作一直倍受世人关注。传统育种方法为棉花生产作出了巨大的贡献,但种间杂交亲和性问题使可用的基因资源受到限制。植物基因工程的发展促进了各种生物之间的基因交流,可以将微生物、昆虫、植物中分离出的有用基因转入栽培作物中,以期获得全新的农艺性状。转基因抗虫棉的大面积推广就是基因工程育种在棉花生产中运用的成功例证。 向棉花基因组中导入外源基因的方法有多种,其中农杆菌介导法是最为有效的方法之一,转入的外源基因多以单拷贝插入,便于育种工作的利用。目前用该方法进行棉花遗传转化通常选用下胚轴或子叶为受体材料,转化周期长,一般需要9~12个月才能获得转基因植株;再生过程中,只有极少数被转化的细胞能够诱导出胚性愈伤组织进而再生为转化植株,转化效率低。本实验利用棉花胚性愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料,绕过了抗性愈伤诱导胚性愈伤的过程,转化周期缩短了3~4个月;所获得的抗性胚性愈伤组织能够直接再生成苗,克服了下胚轴做受体时容易获得抗性愈伤、但不易获得转基因植株的缺点,提高了棉花遗传转化的工作效率;并把一个双价阳离子抗菌肽基因成功地导入棉花。主要结果如下: 1、建立了农杆菌转化棉花胚性愈伤组织的遗传转化体系 利用gus-intron基因瞬时表达技术,研究了影响农杆菌介导棉花胚性愈伤组织遗传转化的因素,进而建立了农杆菌介导棉花胚性愈伤组织的遗传转化体系。研究结果表明:重悬液和共培养培养基中加100μmol/L乙酰丁香酮(Acetosyringone,AS)可以明显提高3个菌株(LBA4404、EHA101和EHA105)的侵染能力,其中LBA4404提高最为明显,为原来的13.6倍;在3种农杆菌菌株中,EHA101侵染能力最强;棉花胚性愈伤组织与菌株EHA101 共培养4d可以获得满意的转化瞬时表达效果;在不同发育时期的体胶中,子叶胚对农杆菌 的侵染比较敏感;实验中采用的3个受体基因型的胚性愈伤组织对农本卜人侵染的敏感性差 异不大。 2、目的基因的转化及转化于的筛选\冉* 建立了稳定的遗传转化体系后,采用携带重组质粒pEASP的农杆菌菌株EHA101进行 了目的基因的转化。胚性意伤组织继代筛选 l-2个月后,生长出新鲜的卡那霉素(Kanamycin, Xill)抗性胚性愈伤组织。KIn抗性愈伤组织块GUS组织化学染色表明:GUS阳性率随转 化批次的不同而有差异,最高可达到90%,最低为20%。GUS阳性Xill抗性愈伤组织液体 悬浮培养2周后,产生大量体胚。体胚在成熟培养基上培养3-4周后萌发,萌发的成熟胚 在体胚伸长培养基上暗培养 2周后 60%左右的体胚伸长。较大的萌发胚(>0,5 cm)在 SH 成苗培养基上培养2个月后80%左右的体肝长出真叶,体胚苗约scm高时移栽成活率较高。 3、转基因植株的分于检测 GUS川一glucuronidase,GUS)组织化学染色结果显示,转化植株的根及叶片切口均呈 蓝色;目的基因PCR扩增结果表明,3个株系的转基因植株均扩增出了与阳性对照相同的 特异带* 和238hpk PCR阳性标系Soutnern杂交结果显示,外源目的基因已经整合进 棉花基因组中。
【学位授予单位】:西南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S562

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