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《西南农业大学》 2004年
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卵胞质移植对兔早期胚胎发育的影响

李军锋  
【摘要】: 女性的生育力随着年龄的增长逐渐下降。当女性进入生殖年龄后期,机体内分泌或卵巢内分泌环境并不是卵母细胞生长和成熟所需的最佳状态,容易导致卵胞质缺陷。卵胞质缺陷还能导致染色体异常,从而致使受精失败和早期胚胎发育停滞。因此,卵胞质缺陷诱发的卵母细胞质量的下降可能是引起许多老龄妇女不育和怀孕失败(流产)的主要原因。近年来,卵胞质移植技术被用于改善老龄妇女卵子的卵胞质缺陷,并取得了良好的临床效果。为了深入了解卵胞质含量在受精和早期胚胎发育中的作用,试验采用卵胞质移植技术,通过增加或减少兔原核期胚胎的少量细胞质,或对兔MII期卵母细胞内进行同种或异种少量卵胞质移植后再显微受精,研究了卵胞质含量和异种卵胞质对受精和胚胎发育的影响。 早期胚胎体外培养系统是进行胚胎工程研究的基本技术之一。因此,我们首先对兔原核期胚胎采用一种较先进的体外培养系统——序贯培养进行了研究。试验采用含低浓度葡萄糖(1.0mmol/L)的R1培养液和含高浓度葡萄糖(3.5mmol/L)的R2培养液对兔原核期受精卵进行了体外序贯培养,并与传统的RID单一培养进行比较,研究了兔早期胚胎在体外序贯培养系统中的发育效果。结果显示,兔原核胚经R1/R2序贯培养后,其桑椹胚率(100.00%)、脱带率(33.33%)、贴附率(59.72%)和外延生长率(43.06%)均显著(P<0.05)高于RD单一培养组(分别为89.65%、5.17%、41.38%和22.41%),但囊胚发育率和囊胚细胞数与RD单一培养组无显著差异(P>0.05)。结果表明,在早期胚胎8-细胞期前后分别采用含低浓度葡萄糖的R1培养液和含较高浓度葡萄糖的R2培养液进行体外序贯培养,能够有效克服兔早期胚胎发育阻滞,提高胚胎的孵化和着床能力。证明序贯培养方式符合早期胚胎的生理需要,较传统的单一培养方式更能促进胚胎的体外发育。 在卵胞质移植研究中,单个胚胎的DNA模板制备是早期胚胎细胞质遗传物质检测的关键技术之一。因此,我们又对单个胚胎的DNA模板制备和线粒体DNA的PCR扩增进行了研究。试验采用KOH/DTT碱裂解法和DNA抽提法制备单个卵母细胞和/或不同发育阶段早期胚胎的DNA模板,用3对引物进行mtDNA片段的常规PCR扩增,比较不同方法制备的DNA模板对PCR扩增效率的影响;并以差速离心法提取的小鼠体细胞mtDNA的PCR扩增结果为阳性对照。结果,采用KOH/DTT碱裂解法处理单个卵母细胞和早期胚胎后,用3对引物进行PCR扩增的总成功率为100%(70/70),而用相同3对引物对DNA抽提缓冲液处理的单个卵母细胞的扩增总成功率为92.9%(65/70),二者差异显著(P<0.05)。但两种方法所制备模板的PCR假阳性率均为0。KOH/DTT碱裂解法处理单个卵母细胞后,紫外分光光度法测得DNA浓度为208.2±6.46μg/mL,OD_(260)/OD_(280)值为0.835~0.944。结果表明,采用KOH/DTT碱裂解法处理的单个卵子或胚胎为模板,能直接从中扩增mtDNA,敏感性和特异性高,经一次PCR扩增即能获得清晰的目的DNA条带,而且扩增效率高,能够满足早期胚胎遗传物质检测的需要。 继而,我们研究了卵胞质含量对兔原核胚体外发育的影响。试验以假注射为对照,采用显 西南农业大学博士学位论文 微注射技术将兔原核期胚胎去除或增加一定量的细胞质:减少5%和20%的细胞质;增加5% 和20%的细胞质;移入5%小鼠MH期卵母细胞胞质。对照组胚胎经假注射后,2细胞胚、8 味细胞胚、桑堪胚和囊胚发育率都极显著(P0 .01)低于未进行显微操作的兔原核胚的体外发育 率,但囊胚细胞数却无显著差异。减质5%组与减质20%组、对照组在2细胞胚、8细胞胚、 :桑堪胚和囊胚发育率上均无显著差异,减质5%组与减质20%组的囊胚细胞数无显著差异 右(P0.05),但均显著少于对照组(P0.05)。增质5%组胚胎的2细胞胚、8细胞胚、桑堪胚 和囊胚发育率均显著高于增质20%组胚胎(P0.05),但与对照组之间无显著差异(P0.05); 囊胚细胞数在两增质组和对照组三者之间也无显著差异(P0.OS)。将5%小鼠MH期卵胞质移 入兔原核胚后,各阶段胚胎发育率及囊胚细胞数与增质5%组、对照组相比均无显著差异 (P0.05);早期胚胎经PCR检测,在2细胞胚(5/5)、8细胞胚(5/5)和桑堪胚(5/5)均全 部检测到了供体小鼠mtDNA的D一loop区3,端片段,但在囊胚(l/5)却仅有l枚能够检测到。 上述结果表明,兔原核期胚胎对显微操作相当敏感,增加或减少少量细胞质不会对兔原核 胚的体外发育造成显著影响,但减少少量细胞质能明显减少囊胚细胞数。并且,异种卵胞质对 兔原核胚的发育没有明显影响,在囊胚期仍能检测到异种卵胞质中mtDNA的存在,但异种 mtDNA随胚胎发育而逐渐减少。 最后,我们研究了兔体内排出的MH期卵母细胞进行同种或异种少量卵胞质移植后再显 微授精的受精和早期胚胎体外发育情况,还应用mtDNA指纹识别技术研究了异种卵胞质移植 胚胎的mtDNA遗传和核质互作。实验分三组进行:第一组进行同种卵胞质移植,供受体均采 用兔MH期卵母细胞,并进行胞质内单精子注射受精;第二组进行异种卵胞质移植,供体为 小鼠MH期卵母细胞,受体为兔MH期卵母细胞,同样移植约5%的卵胞质,并进行胞质内单 精子注射受精;第三
【学位授予单位】:西南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S829.1

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