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《西南农业大学》 2004年
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植物抗菌内生菌A11的分离鉴定及其活性物质的初步研究

李能章  
【摘要】: 植物内生菌作为生活在植物组织内部的一大类微生物,在其生活史的一定阶段或全过程中对宿主植物不表现出病症,由于生活环境的特殊性,在生理生物学作用上与外界环境微生物都有所不同。在长期共同进化过程中,植物内生菌与宿主植物之间形成了一种共生关系,外界环境条件与宿主植物代谢变化影响着植物内生菌的种类及其代谢发生相应变化。随着世界人口的增长,某些癌症,抗药细菌,寄生原生动物和病原真菌严重影响着人们身体健康,寻找更有效药物迫在眉睫。植物抗菌内生菌作为植物内生菌中的一类,能产生多种新的抗菌活性物质,不但可以帮助人类解决健康问题,也可以解决植物和动物健康问题,但现阶段对植物抗菌内生菌的研究刚刚开始,对其特性了解还不够深入,无法对其充分利用,因此,对植物抗菌内生菌的研究不仅能带来巨大的社会效益还具有现实的理论意义。本实验主要选择了一些具有药用功效的植物组织作为抗菌内生菌分离材料,对从芦荟中分离到的一株具有广谱抗菌活性的A11菌进行了种属鉴定,并对其抗菌物质进行了分离纯化。实验结果如下: 1、采用组织表面消毒的方法从银杏、芦荟等十多种植物组织中分离出了115株植物内生菌,其中细菌60株,真菌55株,这些真菌在28℃恒温条件培养大多都不产孢。在这115株菌中共筛选出了5株抗菌活性不同的植物抗菌内生菌,它们分别是从银杏叶中分离到的一株内生真菌(G6)、芦荟叶中的一株内生细菌(A11)、地瓜中的一株内生细菌(F4)、夹竹桃中的两株真菌(N11、N20),其中一株从芦荟组织中分离到的内生细菌(A11)具有广谱的抗菌活性,选择A11做深入研究。 2、内生菌A11具有广谱的抗菌活性,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌有很强的抑制作用,但对革兰氏阴性菌的抑制活性不高,对一些植物病原真菌如番茄晚疫病原菌,桃红粉单端孢菌、桃褐腐病原菌等也有较好的抑制效果,对引起食品腐败的霉菌如青霉、黄曲霉等同样有很好的抑制效果。该菌在初始pH4-10的培养基中都能够生长,生长最适温度范围为28-30.5℃,在PDA、查氏等真菌培养基中生长旺盛,在高氏1号和无氮源培养基中同样生长良好,而在LB与牛肉膏蛋白胨等细菌培养基中生长很差,碳源是其生长的关键因子,这有别于一般细菌的营养需求。在含碳源丰富的培养基上产生大量的粘性物质,而芦荟同样产生大量的粘性物质,它们是否有必然的联系,是否是相互选择的结果,这些问题需要进一步的研究。 西南农业大学硕士学位论文 3、参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》,通过形态学观察, 该菌株在PDA培养基上菌体杆状,产生芽抱,芽抱膨大为中生或近端生,革兰氏染色呈阳性, 对内生菌All做生理生化特征测定,其接触酶阳性,氧化酶为阴性,运动性强,有鞭毛,能 水解淀粉,利用尿素,不降解狡甲基纤维素,v.P阳性,利用葡萄糖等各种糖类产酸产气,硫 化氢的产生和亚硝酸还原都为阴性,兼性厌氧,该菌在不同培养基上菌体的形态有很大的变 化,从短杆状到丝状,生长的最适温度范围28一30 .5℃:对内生菌All做16SrDNA序列测定, 序列长度为1498bP,通过与GenBa川日EMB沁DBJ爪DB该酸序列数据库中的序列进行比对, 该菌与类芽抱杆菌属下的一个菌株尸口‘”才占配亩刀公行万西berisis的序列同源性为99肠,与其它类芽 抱杆菌属下的其它种的序列相似性也在96-98%,基于16SrDNA序列构建了All与这些相关 菌的系统发育树。与All同一簇的其它菌都属于类芽抱杆菌属,因此可以判定内生菌All属 于类芽饱杆菌属,人11虽与尸冶阴亡6配“八绍kribber臼纽的165 rDNA序列同源性在99%,但它们 的生理生化性质又有差别,相反All的生理生化性质与多粘类芽抱杆菌(尸尸。加拟口)的性质 更为相似,因此该菌株应属类芽抱杆菌属中的一个新种。 4、内生菌All产生的抗菌活性物质具有广谱抗菌活性,该物质具有热稳定性,121℃处 理30min活性没有损失,无挥发性,在PH6.0时不带电荷,溶于水,也能溶于甲醉、无水乙 醇、丙酮、正丁醉等极性较强的有机溶剂,不溶于氛仿和乙酸乙醋等极性较弱的有机溶剂, 该物质活性pH范围为2.0一9.0,经处理其pH值在2一9.。之外无活性的发酵液重新调节其PH 到2.0-9.0,其抗菌活性恢复。 、5、发酵液经121℃处理15min,8000rlmin离心5而n取上清液,上清液用2倍体积的无 水乙醇:丙酮(l:l,vo./vol)处理去掉多搪及蛋白质类物质,80001.1而n离心smin取上清液进行减 压浓缩、回收有机溶剂,浓缩液用1倍体积的正丁醇进行萃取,萃取两次,合并萃取相,浓 缩干燥后,水进行充分溶解,用0.22um的滤膜过滤除去不溶物及细菌,过sephadexG一25分 子筛,使活性物质与其它杂质进一步分离开来,实验结果表明用蒸馏水洗脱效果较好,活性 物质在洗脱液被洗脱的体积为凝胶柱体积70%左右时被洗脱出来,合并有抗菌活性的洗脱液 真空冷冻干燥,用少量甲醇溶解,经TLC进一步的分离纯化,活性物质在展开剂配比为乙酸 乙醋:氯仿:甲醉:水(30:40:2 9:1)和硅胶120℃活化1h时分离效果较好,活性斑点与其它 杂质分离较开,活性斑点Rf值为0.59。?
【学位授予单位】:西南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q945

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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