农杆菌介导的紫花苜蓿悬浮胚性愈伤遗传转化体系的建立及nodMDH基因的导入

【摘要】： 铝毒害是酸性土壤上限制植物生长发育的主要因素之一。全世界有39.5亿hm~2酸性土壤，其中可耕土壤面积为1.79亿hm~2，如何解决酸性土壤的铝害问题已经是不容忽视的一项重要课题。紫花苜蓿是重要的豆科牧草，在世界上享有“牧草之王”的美誉，种植面积大，应用广泛。生物技术的发展为耐铝苜蓿新品种的开发开辟了一条新的途径。本实验建立了一套完整实用的苜蓿转化新体系，并将nodMDH基因导入到保定苜蓿中，为利用生物技术改良苜蓿品质搭建了基础平台，并对nodMDH基因的耐铝效果做了初步的分析。主要的实验结果如下： 1、建立了保定苜蓿的农杆菌介导悬浮胚性愈伤遗传转化体系。利用二次再生分离得到高频体胚再生系；利用110～120rpm在液体UM中悬浮胚性愈伤，得到大量均一的对农杆菌敏感的胚性细胞；利用该感受态胚性细胞为转化受体，避过叶盘转化中农杆菌侵染和抗生素筛选对外植体胚性能力的伤害；确定了最佳共培养基浓度(1／4UM)、最适pH值(5.3)以及共培养时间(3d)；对乙酰丁香酮的使用量做了摸索，确定了最佳使用量为100μmol／L；鉴别了各种畸形抗性体胚和次生胚的成苗能力，生于胚根和胚轴上易于分散的次生胚最容易成苗。 2、利用该体系将nodMDH基因导入苜蓿栽培品种一保定苜蓿中。转基因苗在外部形态上和对照并无明显差异。根相对生长量实验证明转基因植株具有一定的铝耐受性，在20μmol／L的Al~(3+)浓度下比对照具有更高的根相对生长量。铝溶液长期处理的根系外部形态具有较大差异，从根尖、根中部和根茎交接处做了比较，发现对照的根系软腐并有紫色菌着生，而转基因植株根系相对保持正常。