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《四川农业大学》 2011年
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禽网状内皮组织增生病病毒囊膜基因gp90的克隆表达及间接ELISA方法的初步建立

余冲  
【摘要】:禽网状内皮组织增生症是一种由反转录病毒科的禽网状内皮增生症病毒(reticuloendotheliosis virus, REV)引起的鸡、鸭、鹅及其他禽类发生的病理综合征,REV感染可引起肿瘤、生长矮小综合征、腺胃炎,更重要的是其感染胸腺和腔上囊等主要免疫器官,引起组织器官萎缩,降低家禽的免疫能力甚至导致免疫抑制,极大的为病毒和细菌的继发感染提供了便利。据报道RE在我国流行趋势有扩大的倾向,其在我国家禽的感染率已达20%~30%,对REV检测预防意义重大。通过克隆、表达REV免疫显性蛋白,本实验旨在建立一种具有快速、准确的ELISA检测方法。 根据禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus, REV) SNV株前基因组cDNA序列,经生物信息学软件分析,发现gp90基因两端抗原活性不高且疏水性强,不利于原核表达的顺利进行。自行设计并合成引物,两端添加限制性内切酶位点EcoRⅠ、HindⅢ,以四川分离株REV-SC1为模板,扩增REV囊膜基因gp90抗原性、亲水性较高的121~1023 bp基因片段,避开两端抗原性低、疏水性强区域;纯化回收目的基因片段,将目的基因克隆至pMD-19T载体,构建重组克隆载体pMD-19T-gp90,转化至大肠杆菌工程菌DH5α,对重组克隆质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定,将阳性克隆重组子送往生物公司测序,对反馈序列进行拼接、比对和分析;使用限制性内切酶位点EcoRⅠ、HindⅢ对重组克隆载体pMD-19T-gp90和原核表达载体pET-32a(+)进行双酶切,纯化回收gp90基因片段和线性质粒pET-32a(+),将基因片段按正确的阅读框架定向克隆至pET-32a (+),构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-gp90,转化大肠杆菌BL21 (DE3),使用PCR方法和双酶切方法鉴定阳性重组子,鉴定无误后送往生物公司测序,对测序结果进行仔细验证,对比克隆测序结果,重点检查是否有基因突变情况;以IPTG对重组大肠杆菌进行诱导表达,使用SDS-PAGE方法和Western-blot方法分别鉴定表达产物大小和抗原性,对表达产物在细菌中的主要存在形式进行鉴定。对包涵体洗涤、纯化、复性,探讨以重组gp90蛋白为包被抗原初步建立检测REV的间接ELISA方法。 结果表明:1)成功扩增gp90基因,重组克隆载体pMD-19T-gp90测序结果表明,REV-SC1株gp90核苷酸序列与GenBank已发表序列同源性最高为99%,于231位、870位发生了2个碱基突变,进化树分析表明,其与黑龙江分离毒株ZD0708、JLR0903亲缘关系最近;2) SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白约为45 Kd,与预期分子量大小相符,Western-blot结果表明重组蛋白具有生物学活性,表达产物主要以包涵体形式存在于细菌内部,对包涵体进行变性、洗涤、复性操作,获得了较纯的目的蛋白;3) ELISA检测方法:最佳抗原稀释度为1:20(包被浓度约为1.5 mg/ml),一抗稀释度为1:320,阳性血清判定临界值为0.126,特异性、敏感性、重复性试验结果良好。 本试验探讨克隆表达REV免疫显性gp90蛋白,并对其在ELISA检测方面的应用作了积极有益的探索,为其商品化、大规模应用奠定了坚实的基础。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S852.65

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