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一个水稻雌雄不育突变基因的精细定位及候选基因的克隆

张曼华  
【摘要】:水稻是世界上最主要的粮食作物之一,半数以上人口以稻米为主要食物。水稻的育性直接关系到其产量的高,因此水稻育性基因的研究具有重要的理论意义和应用价值。近年来,随着大量水稻生殖发育突变体的发掘,已经克隆了一部分与其育性相关的基因,为阐明水稻复杂的生殖机制提供了重要的理论依据。同时,人们已经研究人为的控制水稻的育性,这些尝试对于更有效地利用杂种优势、提高水稻产量具有重要意义。 水稻不育现象主要特征是在有性生殖的过程中不能形成正常的配子,形成正常的配子但是不能够完成双受精,或者能够受精但胚胎发育不正常,从而不能正常的结实。本实验材料MFS-Z9是从中花九号的转基因T2代株系中发现的,它是一个表现雌雄都不育的突变体,前期对该突变体进行了形态学、细胞学和遗传学及基因的初步定位,本文对MFS-Z9进行了精细定位、候选基因的克隆分析和候选目的基因表达载体构建及其转基因的遗传转化。主要结果如下: 1、在雌雄不育基因MDS1初步定位的基础上,在定位区间内开发SSR和Indel标记,通过染色体步移,对候选基因进行实现了精细定位,成功将目的基因定位于85kb的范围内。 2、采用在线预测软件结合水稻相关数据库对精细定位区域进行ORF预测,在定位区域内得到了8个Loci,在这8个预测基因中,LOC_Os02g08430和LOC_Os02g08460推测编码功能未知的蛋白:LOC_Os02g08470推测编码功能未知的保守未知蛋白;LOC_Os02g08440编码水稻Tfs表达蛋白具有WRKY和锌指结构:LOC_Os02g08450推测编码和转座相关的转座蛋白;LOC_Os02g08480编码一种泛素融合降解蛋白;LOC_Os02g08490编码具有分子伴侣功能的clpB1蛋白;LOC_Os02g08500编码在双组分调控中起作用的蛋白。 3、我们对定位区间内的基因进行了克隆测序,并且比对了野生型和突变株的序列差异,发现其间LOC_Os02g08430、LOC_Os02g08480、LOC_Os02g08450、LOC_Os02g08460、LOC_Os02g08470这五个基因的突变株序列和野生型并无差异,而LOC_Os02g08480、LOC_Os02g08490、LOC_Os02g08500则只能扩增得到野生型的片段,而突变株不能得到扩增产物。 4、我们根据不能扩增到区域的野生型序列信息,设计了32对标签引物,对野生型和突变体进行PCR检测,发现区域内只有野生型可以得到扩增产物;进而对F2分离群体进行了PCR检测,同样只有正常株才能得到扩增产物;根据标签位置,推测突变体基因组发生了约20kb的缺失。进一步对野生型和突变体提取RNA进行RT-PCR分析,发现在突变株中该区域的基因均没有表达产物,而在野生型中则正常表达,该结果支持了该区段缺失的推断。 5、对缺失区间内的候选基因序列及其表达情况进行分析,推测LOC_Os02g08480、LOC_Os02g08500与突变体的不育性状可能相关,初步确定为候选基因;根据基因组注释,我们对这两个基因分别构建了功能互补、过量表达、反义表达和RNAi干扰表达等8个载体,并通过酶切和测序的方法鉴定出阳性克隆,将重组质粒转入农杆菌EHA105中得到阳性菌株。 6、通过农杆菌介导的方法将互补表达载体导入突变体幼穗诱导来源的胚性愈伤组织中,经组织培养,抗性筛选、分化,获得了35株转LOC_Os02g08480互补载体的再生抗性小苗;其余过量表达、反义表达和RNAi干扰表达的遗传转化正在进行中。


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