血管瘤型J亚群禽白血病病毒全基因组核酸序列分析及gp85基因的原核表达

【摘要】：J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J, ALV-J)属于反转录病毒,能够诱发本地鸡和野生禽类产生肿瘤、生长迟缓、免疫抑制等,给养禽业带来了巨大的经济损失和严重威胁。J亚群禽白血病病毒自1989年由英国学者分离鉴定出以来,主要引起肉鸡的骨髓瘤白血病,但近年来,以往曾研究证实不易发生肿瘤的中国商品代蛋鸡和地方种鸡受到ALV-J感染后也能诱导产生较高的肿瘤发生率。此外,以往少见的由ALV-J引发的血管瘤病例近几年逐渐增多。这足以表现出不同地域ALV-J感染的特殊性和复杂性。 本研究通过接种鸡胚成纤维细胞(CEF)RT-PCR及PCR检测技术,首次从四川某祖代种鸡场患病鸡中分离鉴定出一株血管瘤型J亚群禽白血病病毒,命名为SCDY1.以分离株SCDY1感染的CEF基因组DNA作为扩增其前病毒基因组模板,根据已公布的原型毒株HPRS-103序列设计合成9对引物,经PCR扩增出9段连续的、部分相互重叠的DNA片段,然后分别连入pMD19-T载体进行克隆并测序。经软件分析,ALV-J分离株SCDY1的前病毒全基因组核苷酸序列最终完成。禽白血病病毒的亚型主要是由病毒膜表面糖蛋白gp85决定的,根据SCDY1病毒株全基因组测序中gp85基因的测序结果,利用Primer permier 5.0设计一对表达引物,用于扩增gp85基因并构建原核表达载体PET-32a(+)/gp85,在大肠杆菌Rosetta中进行表达。 结果表明,SCDYl;株cDNA基因组全长7489 bp。将该序列与GeneBank公布的其它ALV-J毒株全基因组序列进行同源比较,SCDY1株基因组的gag和pol基因相对保守,env基因变异性相对较大。在核苷酸水平上,gag、pol和env基因的同源性分别为94.3-96.5%,96.6-97.6%,90.3-94.2%；在氨基酸水平上,gag、pol和env的同源性分别为96.2-98.4%,97.4-98.7%,85.1-90.7%。SCDYl株E元件和non-functional TM序列几乎完全缺失,在3'UTR的U3区也出现了11个连续核苷酸序列的缺失。U3区转录调控元件分析表明,SCDYl:株U3区11 bp的缺失序列位于调控元件CArGbox的上游,类似于人类基因Apo-AI的转录因子ABI REP1,它可以为HNF-4提供结合位点,与之相结合,而HNF-4又可以作为一种阻遏子,在真核基因调控中起重要作用。此外,构建的原核表达系统成功获得了血管瘤型ALV-J病毒株的gp85蛋白,该蛋白的分子量约为57KD,与预计相符。表达的目的蛋白以包涵体的形式存在于菌体蛋白中。经Western-blot分析表明,该表达产物具有良好的反应原性。