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《四川农业大学》 2011年
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DEV UL53基因主要B细胞抗原表位原核表达及其多克隆抗体制制备和初步应用

张顺川  
【摘要】:论文对鸭病毒性肠炎病毒UL53基因(GenBank Accession No.:EU071035)进行序列特性分析、主要B细胞抗原表位原核表达及其多克隆抗体制备、UL53蛋白的亚细胞定位等研究,主要研究结果如下: 1.UL53基因的生物信息学分析DEV UL53基因完整的ORF大小为1032bp,编码343氨基酸,其理论分子量为38.119KDa,整体为一个完整的保守结构域。UL53基因通过GENSCAN程序预测表明UL53基因被分为最佳外显子区域(1-675bp)和最适度以下外显子区域(676-1032bp); UL53基因编码糖蛋白K在氨基酸残基30处有一个信号肽切割位点、具有3个N-连接糖基化位点、11个潜在的磷酸化位点、四个跨膜区。氨基酸序列相似性比对和系统进化树结果表明DEV UL53基因与a疱疹病毒亚科中禽类疱疹病毒Gallid herpesvirus 2、Gallid herpesvirus 3的UL53基因亲缘关系较近。另外,亚细胞定位预测结果表明DEV UL53基因编码糖蛋白K主要定位于胞质膜。密码子偏嗜性分析表明在该基因偏嗜的密码子中,其密码子第三位碱基几乎全部为T或者A碱基。 2.UL53基因重组表达质粒的构建、原核表达及多克隆抗体的制备根据DEVUL53基因的序列特征推测UL53全基因不易表达,因此结合B细胞抗原表位、最佳外显子区域及跨膜区等参数设计UL53截段基因引物即扩增主要B细胞抗原表位。PCR法分别扩增UL53基因及UL53截段基因进行T克隆,然后分别构建重组表达质粒pET-32b(+)/UL53、pET-32b(+)/tUL53,转化不同的表达宿主菌,经过IPTG诱导表达证实UL53全基因确实不表达,与生物信息学预测结果一致。但是UL53截段基因却可以很好的表达,最佳表达条件为0.4 mmol/L的IPTG终浓度于37℃下诱导8h,表达产物主要以包涵体形式存在。表达的蛋白采用兔抗DEV的全血清作为一抗经过Western blot证实是DEV的蛋白之一,随后纯化的蛋白用于制备兔抗多克隆抗体,通过琼脂扩散试验测定效价为1:32,微量中和试验证实制备兔抗DEV tgK抗体具有1:5.623的抗血清中和效价。 3.UL53基因早晚期类型鉴定①UL53基因转录时相:应用实时荧光定量PCR检测不同时间点DEV UL53基因的转录产物,结果表明感染后10h可以检测到UL53基因的转录产物,随后转录参物量增加,于感染后36h达到高峰,感染后48h其转录量降低;②核酸抑制试验证明UL53基因具备晚期基因特征;③UL53蛋白表达时相:应用Western blot最早于DEV感染鸭胚成纤维细胞后14h检测到UL53蛋白。与其它疱疹病毒研究成果比较,表明编码DEV糖蛋白K的UL53基因属于晚期基因。 4.UL53基因编码蛋白的亚细胞定位及组织定位应用间接免疫荧光法分别检测DEV感染DEF和鸭,结果表明:①DEV感染DEF后12h于胞质检测到UL53蛋白;②于DEV感染鸭的哈德氏腺、胸腺、肝、肾、肺脏、盲肠、十二指肠及直肠均出现明显的阳性信号,脾脏、心肌也检测到阳性信号但是较弱,阳性信号分布于细胞质。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S852.65

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【参考文献】
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