高脂日粮诱导肥胖表型猪相关基因差异表达分析及分子网络构建
【摘要】：目前,随着生活水平的提高,由肥胖引发的糖尿病、代谢紊乱症及癌症的发病率也逐年升高,严重威胁到人类健康,使得肥胖问题成为当今人们关注的焦点。肥胖的发生除了遗传因素外,高脂、高能膳食的摄入也是导致体脂异常蓄积造成肥胖的原因之一,但机理尚不清楚。研究发现肥胖相关性状是由微效多基因控制的；借助肥胖动物模型,通过高通量基因芯片技术筛选与肥胖发生高度相关的基因并分析基因间的相互联系,将是研究肥胖发生分子机制的有效途径。本文旨在借助肥胖猪表型从基因的转录水平全面分析由高脂膳食引起的肥胖发生相关基因表达的规律,通过生物信息学挖掘初步确定此类肥胖相关候选基因。
选择初始体重约20kg的半同胞DLY三元杂交去势猪20头,随机分为2个处理,运用基因芯片技术研究高脂日粮诱导下猪肝脏、骨骼肌、皮下脂肪及肾周脂肪组织基因表达变化规律、互作关系及基因功能分类,筛选出同高脂膳食性肥胖相关的目标基因。具体研究如下：参照NRC(1998)猪营养需要标准,按20-50kg (Ⅰ)、50-80kg(Ⅱ)、80-120kg(Ⅲ)三个阶段,分别配制对照组(Total fat0.82%)与高脂组(按阶段添加猪油,Ⅰ-3%、Ⅱ-5%、Ⅲ-7%)玉米-豆粕型日粮,消化能(DE,MJ/kg)为：对照组(Ⅰ-13.93、Ⅱ-13.97、Ⅲ-13.88)和高脂组(Ⅰ-14.55、Ⅱ-14.97、Ⅲ-15.22)。试验期180d结束屠宰,期间测定体征、生产性能、血液生化指标及细胞因子分泌水平。采用Affymetrix猪全基因组表达谱芯片分析高脂日粮对猪肝脏、骨骼肌、皮下脂肪及肾周脂肪组织的基因表达模式的影响,筛选差异基因,使用GO和KEGG数据库分析差异基因功能及信号转导通路。经Agilent猪全基因组表达谱芯片分析后,构建高脂日粮诱导肥胖表型猪肝脏表达差异基因数据库,基于此数据构建不同层次分子网络,进而确定肝脏中受肥胖表型影响较大的相关基因。主要研究结果如下：
(1)高脂日粮显著提高了试猪体重、背膘厚、腹脂重、眼肌面积和肌内脂肪含量(P0.05),对滴水损失、pH值和大理石纹评分影响差异不显著(P0.05)。采食高脂日粮的试猪空腹血糖、空腹胰岛素、血浆甘油三酯、血浆总胆固醇、血清游离脂肪酸以及血清低密度脂蛋白水平显著高于对照组(P0.05)。高脂日粮对空腹T3、T4水平无显著影响(P0.05),但造成了机体炎性及肥胖相关因子(TNF-α, IL-6, Leptin和ObR)分泌水平的显著提高(P0.05)。
(2)差异基因筛选结果：与对照组相比,高脂日粮组肝脏组织表达差异基因上调478个,下调598个(Ratio≥2为表达上调,Ratio≤0.5为表达下调),占所有肝脏组织检出基因的5.4%；骨骼肌组织表达差异基因有776个(表达上调400个,下调376个),占所有骨骼肌组织检出基因的3.9%；皮下脂肪组织表达差异基因852个(表达上调387个,下调465个),占所有皮下脂肪组织检出基因的4.2%；肾周脂肪组织表达差异基因1038个(表达上调516个,下调522个)占所有肾周脂肪组织检出基因的5.2%。
(3)基因功能注释结果：受高脂日粮摄入的影响,肥胖表型猪4种组织中均有显著差异的基因以转录、转录调节、转运等功能为主,分别占不同组织中上调或下调基因总数的14%-48%。其中各组织上调差异基因主要涉及的生物学功能有：肝脏(脂类合成代谢)、肾周脂肪(糖、脂代谢及胰岛素分泌调节功能)、皮下脂肪(免疫应答、代谢及物质转运)、骨骼肌(肌原纤维合成及转运功能)；下调差异基因主要涉及的生物学功能：肝脏(氧化还原功能、蛋白质转运和信号转导)、肾周脂肪(免疫应答、凋亡和转运)、皮下脂肪(转录和转录调节)、骨骼肌(转录调节和转运)。提示这些生物学功能与高脂膳食引起的肥胖发生相关。
(4)显著信号转导通路筛选结果：高脂日粮的摄入,促进了脂的吸收和脂肪的合成,造成炎性因子分泌的改变,促使机体免疫应答。其中,肝脏和皮下脂肪组织体现的最活跃信号通路与代谢(尤其是脂代谢)及免疫相关；肾周脂肪组织体现最活跃信号转导通路与脂肪细胞因子及细胞增长分化相关；而在骨骼肌组织中,癌症发生以及胰腺分泌相关信号转导通路明显活跃。
(5)肝脏组织功能调控网络分析结果：具有重要调控能力的基因归属于5个功能分类(Degree3),分别是核苷酸代谢过程、细胞过程、蛋白质氨基酸磷酸化负向调控、碳水化合物代谢过程调节以及多糖生物合成调节过程。
(6)肝脏组织信号转导通路调控网络及信号流网络分析结果：免疫、炎性反应及癌症相关信号转导通路受高脂日粮调控较为密集(Degree1)。基于基因间相互作用关系分析后发现,受高脂日粮摄入影响的所有变化基因中,最具调控能力的关键基因有7个,分属细胞色素酶类以及谷胱甘肽转移酶类。
(7)肝脏组织基因间共表达调控网络分析结果：鉴定出11个在两个处理组中的网络调控地位发生改变的共表达基因。建议可作为高脂膳食引起的肥胖相关目标基因进行研究。
【关键词】：猪 脂肪 肥胖 基因芯片 分子网络 【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S828.5
【目录】：
- 中文摘要7-9
- 英文摘要9-12
- 目录12-15
- 1 绪论15-28
- 1.1 前言15-16
- 1.2 研究背景16-22
- 1.2.1 肥胖及其相关代谢病发生的分子基础16-20
- 1.2.2 肥胖模型动物选择及饮食诱导肥胖表型的建立20-22
- 1.3 立题依据22-25
- 1.4 本研究的目标和内容25-27
- 1.4.1 研究目标25
- 1.4.2 研究内容25-27
- 1.5 技术路线27-28
- 2 高脂日粮诱导猪肥胖表型的建立28-34
- 2.1 材料与方法28-31
- 2.1.1 试验设计及试验动物28
- 2.1.2 日粮及饲养管理28
- 2.1.3 样品采集28-29
- 2.1.4 考察指标及测定29-31
- 2.1.5 统计分析31
- 2.2 结果与分析31-34
- 2.2.1 高脂日粮对猪生产性能、体脂沉积及肉质的影响31-32
- 2.2.2 高脂日粮对猪空腹血糖、胰岛素及血脂水平的影响32-33
- 2.2.3 高脂日粮对猪血浆细胞因子浓度的影响33-34
- 3 高脂日粮诱导的肥胖表型猪基因表达谱分析34-57
- 3.1 材料和方法34-39
- 3.1.1 组织样本及其来源34
- 3.1.2 Affymetrix基因芯片34
- 3.1.3 主要仪器与试剂34-36
- 3.1.4 基因芯片杂交试验步骤36-37
- 3.1.5 基因芯片分析37-38
- 3.1.6 芯片质控分析及结果验证38-39
- 3.2 结果与分析39-57
- 3.2.1 猪肝脏、骨骼肌、皮下脂肪及肾周脂肪总RNA电泳结果39-40
- 3.2.2 表达差异基因筛选及分析40-41
- 3.2.3 表达差异基因显著性功能筛选及分析41-50
- 3.2.4 表达差异基因涉及的信号通路显著性分析50-56
- 3.2.5 RT-qPCR验证芯片结果56-57
- 4 高脂日粮对猪肝脏全基因组表达的影响及分子网络构建57-85
- 4.1 材料与方法57-63
- 4.1.1 试验材料57
- 4.1.2 Agilent基因芯片57
- 4.1.3 主要仪器和试剂57-58
- 4.1.4 基因芯片杂交试验步骤58-59
- 4.1.5 基因芯片分析59-62
- 4.1.6 芯片质控分析及结果验证62-63
- 4.2 结果与分析63-85
- 4.2.1 肝脏组织RNA Pool的Bioanalyzer2100电泳结果63-64
- 4.2.2 芯片原始数据标准化结果64
- 4.2.3 差异表达基因分析64-65
- 4.2.4 分子网络构的构建及分析65-83
- 4.2.5 RT-qPCR验证芯片结果83-85
- 5 讨论85-97
- 5.1 高脂日粮诱导猪肥胖表型的建立85-87
- 5.1.1 日粮添加高脂增加猪体脂沉积85
- 5.1.2 高脂日粮提高了猪血糖、血脂水平并增加胰岛素分泌85-86
- 5.1.3 高脂日粮影响体内瘦素作用86
- 5.1.4 日粮添加高脂致机体出现炎性状态86-87
- 5.2 芯片杂交研究肥胖表型相关基因表达87-89
- 5.2.1 芯片实验设计87-88
- 5.2.2 芯片质控88
- 5.2.3 芯片数据分析88-89
- 5.3 差异基因注释89-91
- 5.3.1 基因功能注释及分析89-90
- 5.3.2 基因信号转导通路注释及分析90-91
- 5.4 分子网络构建及目标基因筛选91-97
- 5.4.1 功能调控网络构建及分析92
- 5.4.2 信号通路调控网络构建及分析92-93
- 5.4.3 基因信号流网络构建及分析93-94
- 5.4.4 基因共表达网络构建及肥胖相关目标基因筛选94-97
- 6 结论及展望97-98
- 6.1 本研究主要结论97
- 6.2 值得进一步研究的几个相关问题97-98
- 参考文献98-112
- 致谢112-113
- 附录一113-118
- 附录二118-121
- 附录三121-125
- 附录四125-128
- 附录五128-129
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