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《四川农业大学》 2011年
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簇毛麦(Dasypyrum villosum)矮化突变体鉴定及矮化机理初步研究

蔡鹏  
【摘要】:近年来,随着分子生物学和基因组学的快速发展,应用基因工程技术对作物进行遗传改良已成为提高作物产量的有效途径,培育理想株型已成为作物育种的重要目标。到目前为止,已报到的矮秆、半矮秆基因有很多,但世界小麦品种中矮秆基因多来自农林10号的Rhtl和Rht2和赤小麦的Rht8和Rht9,水稻中只有sd-1在育种中发挥了较为明显的作用,其余大多数都没有育种价值,因为某些矮源极度矮化或者矮化的同时伴随不利的农艺性状,使得真正运用于育种中的矮源较少,所以育种中存在遗传背景单一、矮秆基因单一化等问题。从现有的矮生材料中分离和鉴定新的矮秆基因,可以丰富高等作物的矮秆资源,为解决部分作物矮秆资源单一化等问题提供基础。因此,发掘和鉴定新矮源,定位和克隆新的矮化基因及作用机理等方面的研究,具有重要的理论意义和应用价值。 本实验室于2000年在簇毛麦{Dasypyrum villosum,2n=14,VV)群体中发现一株自然突变的矮秆突变型。本研究拟观察该突变体矮化性状的遗传特性和细胞学特征,考察突变体对外源激赤霉素的反应,分析生长发育时期中,赤霉素合成途径中关键酶基因时空表达情况,并克隆两个关键酶基因GA20ox和GA3ox进行克隆和表达分析,为新的矮源基因的挖掘与利用提供理论依据。 主要研究结果如下: 1.突变型表型特征:突变型与野生型在苗期无差异,在拔节后期开始出现差异,突变型相对矮小,在成熟期,突变体和野生型植株高度差异达到最大,野生型平均株高为119.1cm,而突变株平均株高为33.1cm,仅为野生型的1/4。细胞学观察和考种结果显示,突变体植株矮小是由于茎节数目减少和节间长度缩短造成的。花粉活力实验结果表明,野生型花粉育性达90%以上,而突变型花粉育性只有5%,说明突变型在一定程度雄性不育。 2.突变型矮化性状的遗传分析:本实验对突变株与野生型进行正反杂交F1代均表现正常株高,表明该矮化性状属于隐性突变。F1代植株相互授粉,其中野生型×突变型组合得到270株F2代植株,突变型×野生型组合得到420株F2代植株,两个群体均出现株高分离现象,没有中间类型出现,其野生型与突变型植株分离比分别为96:270和137:420,经卡方检验,其分离比均符合3:1。此外,野生型×突变型/突变型组合中,变型与野生型植株分离比为141:128,经卡方检验,符合1:1的分离比。因此,推测该突变体的矮化性状是由单基因控制的隐性突变。 3.激素敏感性分析:本实验在拔节初期选用10-3-10-7M浓度梯度GA3连续喷施矮秆突变体,发现所喷施的突变体的株高都有不同程度的恢复,在一定浓度范围内,植物株高恢复程度与浓度的升高成正比,说明该突变型是一个赤霉素敏感型材料,且筛选出10-4 M GA3溶液是最佳的外施浓度。进一步研究表明,突变体株高的恢复主要是通过增加节间长度来实现。此外,外施GA3后,植株的花粉育性等都能够恢复到野生型水平,因此,我们推测该矮秆突变体是一个赤霉素缺陷型突变体。 4.根据同源克隆的原理,从野生型和突变型簇毛麦中共克隆到三个GA20ox基因单倍型,单倍型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,长度分别是1293bp、1297bp和1294bp,其中单倍型Ⅰ和Ⅱ存在野生型中,单倍型Ⅱ和Ⅲ存在于突变型中。单倍型Ⅰ和Ⅱ的序列中存在25个多态性位点,其中21个是单核苷酸碱基多态性,4个是缺失或插入位点。在编码区的19个SNPs中有8个SNPs发生非同义突变,并导致7个氨基酸的改变。 GA20ox单倍型Ⅲ序列的外显子1和内含子中序列与单倍型Ⅱ完全相同(除了507和578位点),在外显子2和终止密码子以后序列则与单倍型Ⅰ完全一致。三种单倍型在507位点具有不同的碱基序列,突变体在578位点全部是“T”,在野生型中是缺失或是“T”,且这两个位点均位于内含子中。GA20ox单倍型Ⅰ和Ⅲ表达在整个生长发育不同部位具有相似表达趋势,推测单倍型Ⅲ和单倍型Ⅰ可能是GA20ox两个不同类型,也可能是单倍型Ⅰ的变异类型。 GA20ox基因三种单倍型在营养器官和繁殖器官中均有表达,在植株的生长周期中,GA20ox基因表达在叶片中呈下降趋势,在茎和茎节中呈上升趋势,在根中呈先上升后下降趋势,说明GA20ox基因表达与植物的生长发育紧密联系,可调控植物生长。单倍型Ⅰ和Ⅱ同时发挥作用,Ⅱ和Ⅲ也是如此,且表达趋势相同,推测Ⅰ和Ⅱ,Ⅱ和Ⅲ之间可能存在协同作用,或者两者之间可以部分或者完全的相互取代。 除了拔节期和抽穗期的叶片,三个时期的其他部位中GA20ox单倍型Ⅱ表达量均是野生型高于突变型。在拔节期和抽穗期叶片以及苗期的根中,野生型中GA20ox单倍型Ⅰ表达量要高于突变型中单倍型Ⅲ。在这些部位中具有较高GA20ox基因表达量,意味着具有合成更多活性赤霉素的前体。 5.根据同源克隆的原理,从野生型和突变型簇毛麦中共克隆到两个GA3ox基因单倍型,单倍型Ⅰ和Ⅱ,长度分别是1495bp和1485bp,其中单倍型Ⅰ仅存在野生型中,单倍型Ⅱ则仅存在于突变型中。单倍型Ⅰ和Ⅱ间存在42个多态性位点,其中20个SNPs,22个InDels。在编码区两个SNPs发生非同义突变,并导致两个氨基酸改变。GA3ox基因在营养器官和繁殖器官中均有表达,且GA3ox基因表达具有组织特异性但与GA20ox基因表达特征间存在一定的共性,说明其表达与植物的生长发育紧密联系,也受植物的生长所调控的。 在拔节期,野生型簇毛麦叶片中GA20ox基因表达量小于突变型,但GA3ox基因表达是野生型大于突变型。此外,根、茎和茎节中GA20ox和GA3ox基因表达量都是野生型大于突变型,说明野生型这些部位中合成活性赤霉素量要大于突变型。这可能是植株表型出现差异的分子基础。 6.Q-PCR结果显示,簇毛麦中CPS, KS, KO, KAO, GA2ox基因在所有被检测的野生型和突变型植株的组织中均有表达,却具有表达特异性。CPS基因在各个部位中的表达情况差异不大。KS主要在茎和茎节中高表达,在叶片和根部的表达相对较低。KO基因主要在根部高表达,其次是茎节中。KAO和GA2ox基因主要在簇毛麦叶片和根部高表达,在茎、茎节和穗子中表达量相对较低。 在苗期,CPS, KS, KO, KAO, GA20ox, GA3ox, GA2ox在叶片中表达均是野生型高于突变型,但是根中却相反。可能是突变型通过一种体内平衡机制的调控刺激根部形成更多的活性GA,弥补了叶片中GA合成量的不足,适应了植物的生长需求,所以未出现表型差异。 到了拔节期,CPS, KS, KO, KAO, GA20ox, GA3ox, GA2ox野生型植株叶片、根、茎和茎节中基本上都大于突变型,特别是在根中差异最显著,且根部各个关键酶基因表达在拔节期基本达到发育过程中的最高点。推测簇毛麦的茎和茎节以及根均是GA的合成位点,但根部是赤霉素的主要合成位点,合成的活性GA除了供给根部自身的生长需求外,很有可能运输到植物体的茎或茎节等其他部位维持植物的生长。 CPS, KO, KAO, GA20ox基因在野生型和突变型的各个组织中表达趋势相同,且KS基因的表达野生型和突变型中差异不大,但GA3ox基因在同一时期的同一部位大多是野生型中的表达量要高于突变型,主要是拔节期,甚至包括在拔节期突变型叶片中较野生型中更多的GA3ox作用的前体的情况。因此,我们推测这个突变型的出现可能是由于GA3ox基因的异常表达所导致。
【学位授予单位】:四川农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q341

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