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转基因大豆MON89788标准物质制备和小麦内标准基因比较研究

黄华丽  
【摘要】:本研究主要围绕转基因大豆MON89788标准物质初步研制和小麦内标准基因标准化研究两方面展开。第一部分是制备转基因大豆MON89788基体标准物质,研究结果对保障我国转基因产品标识管理制度的顺利实施具有重要意义,第二部分是小麦内标准基因定量PCR检测方法的比较和标准化,研究结果为小麦内标准基因体系标准化和统一化提供了详实的数据。 1.转基因大豆基体标准物质制备 利用非转基因受体亲本A3244和纯合转基因大豆MON89788的种子为材料,初步制作了适用于转基因大豆MON89788检测的基体标准物质。本研究以优化后的研磨和干燥条件将原材料进行粉碎和干燥,分别测定和比较了研磨后A3244和MON89788粉末的颗粒粒径分布、含水量和DNA抽提效率,结果表明二者都具备相似的颗粒大小、含水量和DNA抽提效率。将MON89788和A3244粉末按照一定的重量比例配比混合,搅拌均匀,配制成MON89788的重量比为5%、1%0.5%的基体标准物质。经测定,84%的粉末典型颗粒大小小于180μm,转基因含量为5%、1%、0.5%的基体标准物质含水量分别为3.03、3.02、2.96。转基因禽含量为5%、1%、0.5%的基体标准物质均匀性测试的F检验值分别为1.22、1.17、1.25,均匀性测试证明研制的3种不同转基因含量的标准物质都具备良好的均匀性。 2、小麦内标准基因比较研究转基因成分的定量分析检测需要可靠的内标准基因体系。到目前为止,多种小麦内际准基因及检测方法,例如脱落酸激酶(PKABA)、乙酰胆碱羧基酶(acc1)、颗粒结合淀粉合成酶(waxy-D1)、铝激活苹果酸转运蛋白(ALMT),已经用于转基因小麦的定量检测。为了比较这几种内标准基因体系在定量检测中的适用性,我们分析了43种不同地域和不同生理背景的常规小麦种植品种中这些内标准基因的扩增序列,发现acc1、ALMT和PKABA基因的定量扩增区含有一个或两个SNP,位点并其对定量分析造成了较大的偏差,然后通过定量PCR和GeNorm软件分析方法评估了在这43种小麦品系中各内标准基因体系的定量重复性和稳定性。结果表明在不同的小麦品系中,waxy-D1基因的定量靶标区并没有检测到有单核苷酸多态性,在不同DNA模板浓度水平下(50ng、5ng和1ng每反应),waxy-D1基因在3组实验水平下都具有最小差异的Ct值(29.72±0.46,33.0±0.41和35.44±0.41)。waxy-D1基因在比较不同内标准基因的定量一致性时具有最小差异的Ct值(29.72±0.46,33.09±0.41和35.44±0.41)。


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